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        注意!研究發現微生物擴增子相對定量測序可能會產生誤導性結果


        原創 上海天昊生物 
         


         




         

        英文題目:Relative Abundances of Species or Sequence Variants Can Be Misleading: Soil Fungal Communities as an Example
        中文題目:物種或序列變異的相對豐度可能會產生誤導:以土壤真菌群落為例
        期刊名:Microorganisms
        影響因子:4.122

         

         
        文章摘要
        相比于傳統的單一栽培農田而言,可持續的植物生產系統是未來農業發展的方向。農林業(Agroforestry)具有眾多的環境效益,是最有希望的替代方法之一。盡管土壤真菌是植物生產力和生態系統過程的關鍵驅動力,但在溫帶農林系統中對這些微生物的研究很少,使得人們對農林實踐下的農業系統的理解不完整。在這里,研究者通過擴增子測序評估了土壤真菌群落的組成和多樣性,以及以溫帶楊樹為基礎樹行間種植農作物(農林)和單作農田系統中真菌類群的頻率(相對豐度)。使用從擴增子測序獲得的物種或ASV的相對豐度分析微生物組忽略了微生物群的大小,這會導致一系列問題。因此,本研究檢測了所選真菌類群的絕對豐度以及真菌總種群規模。樹行強烈影響群落組成,增加了土壤真菌的種群數量和物種豐富度。此外,樹行對外生菌根起到強烈的促進效果。研究者推測菌根提高了未施肥的樹行的養分獲取,從而有助于系統的總生產力。相對和絕對豐度的比較揭示了顯著的差異,強調了僅靠擴增子相對定量測序不能充分評估菌群規模和動態。本研究結果強調了將基于擴增子測序的相對豐度數據與絕對定量相結合的必要性。

         

         
        背景介紹
        農林業(Agroforestry)是一種將作物和樹木結合起來的替代性農業用地,采用作物與樹木交替種植方式,是一種流行的復合農林業。與傳統的單一栽培農田相比,農林業的主要優勢是其在樹木和作物之間互補利用資源的潛力,這最終導致系統更高的資源利用效率。最近的研究表明,對農林復合系統和單一栽培的農田作物進行相比,發現以楊樹為基礎的農林復合系統可以增加土壤中細菌與真菌的比率及豐富度。
         
        盡管土壤真菌群落包括許多有益的植物共生體、病原體及其拮抗劑,并且是生態系統過程的關鍵驅動因素,但溫帶農林系統土壤真菌群落的研究還是較少。本研究旨在利用擴增子相對定量測序和絕對定量技術,來調查德國三種楊樹混作系統(農林-耕地系統)土壤真菌群落的組成、豐度和多樣性。

         

         

        實驗方法

        本研究是在德國的三個成對的農林業和傳統的單一栽培農田進行的(圖1A)。農林系統是2007年至2010年建立的以楊樹為基礎的樹行區域種植系統。同一楊樹是在每個地點用插條人工種植的。12米寬的楊樹行是南北向的,與48米寬的農作物行交替排列,在每個地點,農林復合系統和單一耕作農田系統都建立了四個重復地塊(圖1B)。


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        圖1、農林復合系統和單作農田的取樣地點和研究設計示意圖。(A,C-E)研究地點位置,具體為德國的Calcaric Phaeozem、Gleyic Cambisol和Vertic Cambisol區。(B)土壤樣本取樣圖。溫帶農林耕地的每個重復地塊內的土壤樣本是在樹木行的中心以及距離樹木1、7和24米的作物行收集的。在單一栽培的農田中,在每個重復地塊的中心收集土壤樣品。

         

        在每個地點的20個采樣點采集了頂部5 cm深度的土壤樣本,共計60個樣本,之后低溫運送到實驗室后,進行標準化DNA提取,使用qPCR來檢測抑制物質對擴增的影響,之后進行標準化文庫制備和Illumina測序,利用QIIME 2進行數據分析。繪制了分級二次采樣(SRS)曲線(圖2)。土壤真菌的絕對定量使用qPCR方法進行測定,研究者進一步還選取10個真菌屬/種進行絕對定量檢測。


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        圖2、SRS曲線和用于使用SRS進行標準化的序列計數數量。AF =農林系統,ASV =擴增子序列變異體。

         

         
        實驗結果
        土壤真菌的群落組成和多樣性
        獲得的4969個真菌ASVs包括14個真菌門,其中子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門數量最多。最豐富的三個綱是糞殼菌綱、座囊菌綱和傘菌綱(圖3A)。最豐富的科是赤殼科和被孢霉科(圖3B)。      


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        圖3、農林復合系統和單一栽培農田系統中土壤優勢真菌(A)綱和(B)科的相對豐度。

         

        使用NMDS和CAP對群落構成的分析表明土壤真菌群落的組成主要受地點影響,然后是采樣位置(圖4A,B)。此外,兩種排序方法都表明,農林系統的作物行和單作農田之間的差異可能是取樣地點之間群落組成差異的原因(圖4A,B)。


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        圖4、農林復合系統和單作農田系統中土壤真菌群落的β多樣性。

         

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        圖5、土壤真菌群落的α多樣性及其與樹行的相關性。(A–C)真菌ASV的α多樣性檢測。使用線性混合效應模型測試采樣位置之間的差異(作物行內的樹行,距離樹行1米、7米和24米)。(D–F) Spearman分析檢測α多樣性與樹行距離的相關性。

         

        土壤真菌分類群絕對豐度和相對豐度的比較
        土壤真菌在樹行中比在農田(農林作物行和常規單一栽培農田)中更豐富,并且它們的豐度隨著與樹木的距離增加而降低。在樹行土壤中的擔子菌門的相對和絕對豐度大于在耕地土壤中(圖6C,D)。雖然與耕地相比,子囊菌亞門的絕對豐度在樹下有所增加(圖6B),但其相對豐度在樹行中低于耕地(圖6A)。


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        圖6、子囊菌和擔子菌在不同采樣點的相對豐度(A, C)和絕對豐度(B, D)。

         

        鏈格孢屬在單一農田中的相對豐度和絕對豐度都大于在樹行中的相對豐度 (圖7A)。在樹行中比在作物行和單作系統中1米和7米的距離低(圖7B)。楊樹行的建立不影響枝孢屬的相對和絕對豐度(圖7C,D)。木霉菌的相對豐度在樹行比單一農田低(圖7E),絕對豐度樹行大于單一農田(圖7F)。鐮刀菌的相對豐度在樹行中低于耕地(圖8A),并且與離樹行的距離呈正相關(圖8B)。


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        圖7、鏈格孢屬、枝孢屬和木霉屬在不同采樣點的相對豐度和絕對豐度。

         

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        圖8、鐮刀菌相對豐度以及與樹行距離的相關性。

         

         

         
        研究結論
        農林耕地系統中的樹行增加了土壤真菌的種群規模和物種豐富度。種群數量和物種豐富度都隨著離樹行距離的增加而下降。在微生物組的相對豐度和絕對豐度之間發現的巨大差異表明,不能單純通過常規的擴增子相對定量測序來評估種群規模和動態。這些結果強調了將擴增子相對定量測序與絕對定量以及總微生物種群規模相結合的重要性。

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        常規擴增子測序技術和qPCR技術技術痛點

        常規16S、ITS擴增子測序技術雖然其具有高通量,低花費,可客觀還原菌群結構及相對豐度比例的巨大優勢,但是其是通過某一OTU分類單元的序列數所占總序列數的比值來獲得某個細菌或真菌的相對豐度比例信息,然而相對豐度信息不能反映樣本中物種真實的絕對豐度情況,例如微生物某一類群的相對豐度比例增加不一定真正是相應微生物類群的絕對豐度增加,可能是其它微生物類群的絕對豐度減少是導致其在群落結構中相對豐度比例的增長,因此常規16S和ITS擴增子測序技術基于相對定量分析的錯誤結果解釋可能導致假定的因果關系!

        qPCR絕對定量技術雖然可以進行物種絕對定量分析,但是qPCR定量實驗結果常常不穩定,且特定物種qPCR需要設計特定引物,對引物特異性要求較高,且引物優化難度較大,導致常規的qPCR絕對定量實驗不再適用于組成較為復雜的環境樣本微生物絕對定量。此外,當環境樣本中往往含有腐殖酸,這些腐殖酸會通過抑制酶的活性抑制PCR,從而影響qPCR對細菌和真菌拷貝數定量結果的準確性。

         

        天昊生物Accu16STM細菌絕對定量測序技術簡介

        本技術是一種將qPCR絕對定量技術和常規16S和ITS擴增子測序技術合二為一的技術,該技術不但可以進行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析、指標和微生物相關性分析等常規16S和ITS擴增子測序分析,關鍵可以解析樣本中總細菌的絕對拷貝數,還可以解析樣本中每個物種的絕對拷貝數,因而對微生態學內許多懸而未決的問題具有進一步闡明的潛力。此外,該技術進行細菌和真菌拷貝數定量時,構建標準曲線的內標和樣本DNA是在同一個樣本孔中一起進行PCR反應,所以PCR反應效率相同,然后上機測序。因此校正了腐殖酸對PCR的影響,避免了腐殖酸等PCR抑制物對樣品細菌16S和真菌ITS拷貝數定量的影響,因此針對土壤、水體和淤泥等環境樣本以及糞便等醫學樣本,天昊生物16S和ITS擴增子絕對定量測序技術計算得到的細菌16S和真菌ITS拷貝數相對于qPCR更準確。

         

        天昊生物Accu16STM細菌絕對定量測序技術發表文章情況

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        天昊生物微生物擴增子測序相關鏈接:

        向“真”而生!天昊生物AccuITS真菌絕對定量測序服務重磅上線;

        ●喜訊!天昊16S擴增子絕對定量測序項目文章登陸《Bioresource Technology》;
        又一篇!天昊Accu16S細菌絕對定量測序項目文章登陸國際頂級環境工程雜志《Bioresource Technology》
        淺談:論微生物絕對定量VS相對定量的優越性;
        祝賀!天昊Accu16S細菌絕對定量測序項目登陸頂級環境雜志《Journal of Hazardous Materials》;
        專屬含PCR抑制劑的環境樣本微生物拷貝數定量的最佳解決方案!;
        天昊16S擴增子絕對定量測序項目新文:金針菇β-型糖苷多糖對結腸炎小鼠的抗炎及腸道菌群調節作用;
        喜訊!天昊生物16S擴增子絕對定量測序項目文章再次登陸《Science of the Total Environment》;
        祝賀!天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術助力客戶登陸Science of the Total Environment;
        又一篇!天昊生物微生物16S擴增子絕對定量測序技術再發好文;
        天昊微生物項目文章:水生高等植物凋落物分解過程中細菌與真菌之間的相互作用;
        【昊文章】天昊客戶細菌+真菌擴增子測序文章見刊《Frontiers in Microbiology》;
        The ISME Journal:為什么微生物相對定量不能代替絕對定量;

         

         

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