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        【昊文章】天昊WGS平臺助力客戶解析PFIC1疾病未能被WES技術檢出的致病突變-- ATP8B1 基因的大片段缺失/重復


        原創 上海天昊生物 
         
         

        “昊”項目文章

         
         
         
         
         
        近日,復旦大學附屬兒科醫院肝病科王建設教授課題組發表文章解析了進行性家族性肝內膽汁淤積癥1型的新變異------來源于ATP8B1 基因的大片段Deletion/Duplications,這些位點在以往的WES平臺檢測中未能檢出。這一成果于9月17日在線刊登于《JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》期刊。天昊生物遺傳檢測平臺對此項目進行了全程協助。
         

        下面小編就帶大家一起學習一下這篇文章,

        看看這次的致病位點如何被WES忽略,卻又能被WGS發現。

         

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        英文題目:Whole-genome sequencing reveals large ATP8B1 deletion / duplications as "second mutations" missed by exome-based sequencing
        中文題目:全基因組測序發現ATP8B1大片段缺失/復制是外顯子測序所遺漏的 "第二個致病突變"
        發表期刊:《JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》
        影響因子:5.57

         

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        研究背景

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        ●進行性家族性肝內膽汁淤積癥1型(PFIC1)是由ATP8B1的雙等位基因突變引起的。

        ●在一些被臨床診斷為FIC1疾病的患者中,最初的基因檢測(Sanger測序和panel測序)只發現了一個已證實或預測的ATP8B1的致病變異。


         

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        研究目的

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        對臨床診斷為FIC1疾病但沒有基因診斷的患者(即只檢測到一個已知的ATP8B1變異)進行WGS篩查,以探究WGS是否可以 檢測到新的ATP8B1變異。

         

         

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        研究方法

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        樣本收集:回顧了從2004年8月到2019年10月收集的非親屬關系的患者的遺傳結果,這些患者有肝內膽汁淤積癥,且血清γ-谷氨酰轉肽酶活性正常、血清總膽汁酸(TBA)升高。從40名臨床診斷為高度疑似ATP8B1疾病的患者中,排除了那些通過Sanger測序(26例)和panel測序(6例)確定為攜帶ATP8B1的雙致病突變的患者。剩下的8名患者中,均只有一個被證實的ATP8B1致病變異,其中7人被臨床診斷為PFIC1,第8人被臨床診斷為良性復發性肝內膽汁淤積癥1型。有4名PFIC1患者有DNA樣本,被選擇用于WGS檢測。
        實驗方法:WGS(30X);一代驗證;cDNA測序等。上海天昊提供了WGS實驗和相關數據分析支持。

         

         

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        研究結果

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        4名患者的臨床特征和攜帶的一個已知ATP8B1致病位點。


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        WGS的遺傳發現

        在P1、P2和P3中,各發現一個SV(ATP8B1的三個不同重排),包括一個拷貝數缺失和兩個拷貝數重復。
        1)在P1中,NC_000018.9:g.55396649_55403075之間的測序深度下降,表明有一個6426bp的缺失(圖1)。通過Integrative Genomics Viewer對映射的read進行分析,確定斷點位于內含子1和內含子2。精確的斷點和長度通過Sanger測序確定為NC_000018.9:g.55396652_55403080,長6427 bp(圖1)。據預測,這將導致第2外顯子的完全喪失。該外顯子包含ATP8B1翻譯的四個轉錄本的起始密碼子,因此會導致ATP8B1合成的完全喪失(NP_001361314.1)。
        2)在P2中,通過Integrative Genomic Viewer查看器確定了一個10,717bp的重復,位于NC_000018.9:g.55335903_55346620,串聯在基因的方向上,斷點位于內含子15和內含子18(圖1)。Sanger測序確定了精確的斷點為NC_000018.9:g.55335906_55346620,長度10,715 bp。這導致了16至18號外顯子的重復,導致讀碼框遷移和形成一個提前終止密碼子:p. Leu700ValfsTer15(NP_001361314.1)。這可能導致ATP8B1的截短形式蛋白的合成。
        3)在P3中,通過Integrative Genomic Viewer查看器確定了一個2303bp的重復,位于NC_000018.9:g.55362031_55364334,串聯在基因的方向上,斷點位于內含子8和內含子10(圖1)。
        Sanger測序確定了精確的斷點為NC_000018.9:g.55362063_55364293,長度2231 bp。這導致了9至10號外顯子的重復,導致讀碼框遷移和形成一個提前終止密碼子:p. Gly314-GlufsTer4 (NP_001361314.1),預測結果導致無義介導的mRNA衰變。這三個CNV在基因組聚集數據庫和內部數據庫中都不存在。
        這三個變異的更多信息可以在Clinvar中找到(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar),其登錄號為SCV001775481, SCV001775482, 和SCV001775483。
        4)P4中,沒有找到相關結構變異,但是我們重新分析了一個ATP8B1的罕見同義突變(NM_001374385.1:c.1029G>A,P_001361314.1:p.Thr343Thr)。該變異是父系遺傳的,涉及第11號外顯子的最后一個堿基,在最初的測序中被忽略了。人類拼接搜索器分析預測c.1029G>A破壞了一個供體位點,提示了其致病性。堿基替換和復合雜合狀態通過Sanger測序進行了驗證。由于P4患者沒有肝組織,但是ATP8B1也在血液中表達。通過對血液表達的ATP8B1進行cDNA測序,只檢測到了攜帶已知ATP8B1突變的序列,提示攜帶c.1029G>A的轉錄本發生了降解.


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        圖1 Structural variants identified in three patients by whole-genome sequencing (WGS)

         

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        討論

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        WGS使我們能夠從遺傳學上確認ATP8B1疾病在四名患者中的存在。其中三名患者(P1至P3)的變異在數據庫中沒有記錄,它們位于內含子的深處,并且是大片段的SV(g.55396652_55403080del,g.55335906_55346620dup, and g.55362063_55364293dup),都不在外顯子測序所能檢測的范圍內。WGS還促使人們注意到P4患者中的同義變體 (c.1029G>A, p. Thr343Thr),這個位點在WES中檢測到了,但是被忽略了。

         

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        結論

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        這項研究表明,WGS檢測是對疑似ATP8B1疾病的常規遺傳學診斷的補充。其結果拓展了ATP8B1疾病中已知的遺傳變異范圍,并詳細說明了ATP8B1的第一個基因組重復與肝內膽汁淤積癥有關,它還說明了ATP8B1的一個同義變異的致病性。

         

        相關文章鏈接:

        【昊文章】2018年《Brain》+2019年《 Movement Disorders》:基因內含子區的重復插入突變不容小覷

         

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