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        祝賀!天昊Accu16S細菌絕對定量助力脫氧海水微生物碳氮循環研究登陸一區《Environment International》


        原創 上海天昊生物 
         
         

         昊項目文章
         

        近期,由廈門大學海洋與地球科學學院、山東大學海洋科學與技術研究所及海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室等單位合作,在國際頂級環境科學與生態學期刊《Environment International》(IF=9.62,一區Top)上發表最新了研究成果。研究者通過使用微生物擴增子測序和宏轉錄組技術,研究了渤海脫氧海水中微生物群落的結構和轉錄活性模式,進一步揭示了脫氧環境中微生物介導的碳和氮循環過程。
        在本項研究中,天昊生物有幸承擔了微生物Accu16STM細菌絕對定量測序工作,在恭喜客戶取得好成績的同時,讓我們簡單看下這篇文章。

                                                     

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        英文題目:Transcriptomic evidences for microbial carbon and nitrogen cycles in the deoxygenated seawaters of Bohai Sea
        中文題目:渤海脫氧海水中微生物碳氮循環的轉錄組學證據

        期刊名:Environment International

        影響因子:9.62 (一區Top)
         

         

        研究概要

        富營養化引起的水體脫氧在沿海海洋環境中持續發生,并改變群落結構、代謝過程和能量分流,導致對生態環境的重大威脅。中國渤海季節性脫氧事件頻發,然而,脫氧如何影響微生物的功能與活性仍不清楚。在這里,我們通過使用Accu16STM細菌絕對定量測序和宏轉錄組方法,研究了脫氧海水中的微生物群落結構和轉錄活性模式。優勢菌是變形菌門Proteobacteria (1.4 × 106拷貝ml-1)、藍細菌門Cyanobacteria (3.7 × 105拷貝ml-1)、擬桿菌門Bacteroidetes (2.7 × 105拷貝ml-1)和奇古菌門Thaumarchaeota (1.9 × 105拷貝ml-1)。在各種環境因素中,溶解氧、酸堿度和溫度與微生物群落組成和功能活性的相關性最為顯著。宏轉錄組的數據顯示,奇古菌在脫氧水中具有較高的轉錄活性,相關的氨氧化、氨轉運和固碳途徑的核心基因表達顯著增加。參與光合作用和固碳途徑的藍細菌轉錄本在低氧水域顯著減少。與此同時,表層和底層水中核酮糖二磷酸羧化酶編碼基因的轉錄本從光自養生物轉變為化能自養生物形式。此外,轉錄組結果表明異養生物在轉運低分子量溶解有機氮中起到了關鍵作用。微生物抗氧化活性相關轉錄本豐度的增加對應于低氧海水中奇古菌有氧代謝的增強??偟膩碚f,我們的轉錄證據顯示,在低氧水生環境中,奇古菌尤其是沿海生態型的氨氧化古菌種群顯著增加,表明化能自養固碳對碳流動的貢獻增強。
         
         

        背景介紹

        過去50年來,海洋中的溶解氧(DO)水平一直在持續下降,預計到本世紀末,全球海洋將損失大約34%的溶氧能力。DO的減少將直接威脅水生生態系統中需氧生物的生長和生存,增加生態系統可持續性的壓力,降低生物多樣性和漁業產量。溶解氧的下降還將限制生態系統能量學,改變生態系統結構,并嚴重影響微生物介導的碳、氮、磷和微量金屬等元素的生物地球化學循環。群落組成和代謝過程的微生物多樣性會受到缺氧的顯著影響。氣候變暖作為已知的海洋脫氧機制之一,直接降低了氧的溶解度,通過強化分層作用減緩了水循環,還促進了微生物呼吸,導致溶解氧濃度降低。營養物質過量排放導致的近岸水體富營養化是缺氧頻繁發生的另一個重要驅動因素。持續的養分輸入將刺激透光層的初級生產力。生產力的提高將產生更多有機物為異養生物提供燃料,并促進水體和沉積物中的微生物呼吸,消耗大量DO,導致沿海生態系統面臨更嚴重的脫氧環境問題。
        包括細菌和古菌在內的微生物雖然體積小,但數量非常豐富,總生物量極大,是海洋生態系統中物質和能量流動的主要通道。海洋脫氧將迫使生態系統物質和能量流從高級別的捕食者轉向低級別的微生物轉變。研究表明,微生物在低氧環境下甚至在缺氧條件下仍然可以有氧生長。大多數關于低氧區的研究主要集中在低氧的形成機制及其對生物元素(如碳、氮和硫)生物地球化學循環的影響。然而,脫氧水中微生物的適應機制和環境調節因子卻鮮有研究。功能活動,特別是它們在低氧水域中調節碳和氮循環的作用,仍然不清楚。
        最近,中國典型的沿海地區,包括長江口、珠江口、黃海和渤海,都經歷了季節性缺氧事件,通常在6月至9月觀察到低氧或缺氧帶。這里,溶解氧濃度介于缺氧的常規定義和氧飽和條件之間的海水被認為是“低氧海水”。利用Accu16STM細菌絕對定量和宏轉錄組技術,我們研究了缺氧渤海優勢細菌和古菌的群落組成和轉錄活性變化。因此,我們將低氧海水中的優勢原核生物群及其功能活性與氧飽和環境中的優勢原核生物群及其功能活性進行了比較,以在轉錄水平上揭示脫氧環境中微生物介導的碳和氮循環。
         

         

        實驗方法

        樣本采樣是在中國渤海兩個地點進行的(1)。根據每個測站的總水深和溫躍層,使用附著在電導率-溫度-深度(CTD)取樣器上的10 L Niskin瓶從表層、中層和底層三個深度采集海水樣本(1)。在船上即時測量溶解氧濃度。本文將低氧海水定義為缺氧(2mg·l-1)至氧飽和狀態(7mg·l-1)。然后根據地表水和底水中溶解氧濃度的分布確定低氧區(1)。地點A31A45的特點是水文條件相似,但溶解氧濃度不同(1b和表1)。在代表低氧環境的地點A31A45表層之下,溶解氧濃度分別為5.115.47 mg·l-13.923.96 mg·l-1;而表面在氧氣中飽和(1a和表1)。因此,選擇表面層和非表面層的樣品進行比較。16S rRNA基因和宏轉錄組分析的樣本是從兩個部分獲得的。通過尼龍篩網(20 mm)、聚碳酸酯濾膜(3 mm)和聚碳酸酯濾膜(0.22 mm)過濾海水,收集相應粒徑的微生物。用于宏轉錄組分析的樣品一式三份,保存在RNA later中。此外,還收集濾液,用于以后的硝酸鹽(NO3-N)、亞硝酸鹽(NO2-N)、銨鹽(NH4-N)、溶解無機磷酸鹽(DIP)和溶解硅酸鹽(DSi)濃度分析。濾膜儲存直到在實驗室測量葉綠素a、顆粒有機碳和有機氮的含量。


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        1、(a)表層水和(b)底層水中溶解氧的采樣點和基于調查的分布。在A45A31站點觀察到底層水中溶解氧濃度最低。

         

        1、渤海兩個脫氧地點(A31A45)的環境參數??s寫:DO,溶解氧;Chl a:葉綠素a;DIC:溶解無機碳;DIP:溶解無機磷酸鹽;DSi:溶解硅酸鹽;DOC:溶解有機碳;POC:顆粒有機碳;PON:顆粒有機氮;TPA:總原核生物豐度。


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        環境測量中的海水溫度、酸堿度和鹽度是用CTD探頭測量。溶解氧是用溫克勒法在船上測量的。溶解氧飽和度(溶解氧%)的計算方法是現場測量的溶解氧濃度除以與大氣平衡時的溶解氧濃度。使用高效液相色譜法測量Chl a濃度。根據標準比色方法分析NO3-N、NO2-N、DIPDSi的濃度。使用靛酚藍分光光度法測量NH4-N濃度。使用流式細胞儀測量原核生物總豐度。
        之后分別提取樣本中的微生物群落DNARNA,并進行16S rRNA基因的相對和絕對定量測序,以及宏轉錄組測序,并結合樣本分組信息進行生信分析及數據統計。
         
         

        實驗結果

        兩個地點的三個采樣深度的環境參數如表1所示,數據表明兩個研究地點的水文條件相似。
        按照門和科分類的微生物組成及轉錄情況如圖2所示。16S rRNA基因的高通量測序產生了6918OTUs,屬于45個門,其中變形菌(49.2%)、擬桿菌(10.8%)、絲狀菌(5.3%)、放線菌(5.1%)和疣狀菌(1.4%)是主要的異養類群(2a)。作為光自養和化能自養的優勢類群,藍細菌和奇古菌分別占總微生物豐度的15.9%8.1%(2a)。上述9個優勢門占總相對豐度的95.9%,其余36個門僅占4.1%。從表層水到底層水,藻的相對比例顯著增加(p < 0.01),而藍細菌的相對比例顯著降低(p < 0.01,圖3a)。


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        2、A31A45位點自由生活(0.2-3.0 mm)和顆粒相關(3.0-20 mm)原核生物群落的微生物組成柱狀圖,包括門(a-c)和科(e-f)分類。相對16S rRNA基因序列數據(ad)、絕對定量16S rRNA基因序列數據(be)和轉錄本分類(cf)反映了表層、中層和底層微生物組成的動態變化。

         

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        3、表層和底層低氧區海水中優勢菌群的變化。
         
        16S rRNA基因的絕對定量總共鑒定了45個門。地表水的總豐度高于底層,這與流式細胞儀測量的原核生物總豐度的趨勢一致(1)。優勢門主要包括變形菌(平均值,1.4 × 106拷貝ml-1)、藍細菌(3.7 × 105拷貝ml-1)、擬桿菌(2.7 × 105拷貝ml-1)、疣孢菌(1.9 × 105拷貝ml-1)、放線菌(1.5 × 105拷貝ml-1)、普朗克菌(5.5 × 104拷貝ml-1)、疣孢菌(2.4 × 103拷貝ml-1)、硝基菌在這些優勢門中,變形菌門、藍細菌門和奇古菌門分別占總豐度的54.7%、14.9%7.6%。包括變形菌和藍細菌在內的優勢細菌的絕對豐度都隨著水深的增加而降低,而奇古菌門、硝化刺菌門和硝化螺旋菌門則呈現出相反的分布模式(3b)。深度和溶解氧濃度對優勢門的多樣性沒有顯著影響(3b)。在系統發育科水平上它們的相對和絕對豐度沒有隨著氧濃度的降低而顯著變化。
         
        在測量的環境因素中,溶解氧、酸堿度、溫度、水深、DIN、DIPDSi濃度在調節渤海低氧水域微生物群的組成和轉錄活性方面起著重要作用。奇古菌門、硝化刺菌門和硝化螺旋菌門的轉錄活性與DO、pH和溫度呈顯著負相關,而藍細菌的轉錄活性與這三個因素呈正相關(4)。此外,奇古菌和藍細菌的轉錄活性分別與水深呈正相關和負相關(4),間接暗示DO和光對微生物分布的調節。奇古菌的轉錄本與NH4-N濃度呈負相關,硝化刺菌和硝化螺旋菌的轉錄本與NO3-N濃度呈正相關(Mantelr > 0.5,p < 0.001,圖4)。這些相關性直接表明轉錄本的功能組成也受到DIN濃度的顯著影響。


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         4、缺氧海洋微生物群落組成的環境驅動因素。熱圖顯示了環境因素和優勢微生物群之間的比較,顏色梯度表示Spearman’s相關系數。分類(絕對和相對豐度)和轉錄功能群落組成與每個環境因子相關通過Mantel partial檢驗。邊緣寬度對應于對應距離相關性的Mantel’s r統計量,邊緣顏色表示基于9,999個排列的統計顯著性。
         

        轉錄分析揭示了缺氧渤海海水中三種主要的微生物生活方式:(a)光自養,(b)化能自養和(c)異養。根據直向同源群(COGs)簇的分析,來自奇古菌和藍細菌的轉錄本顯示出在“能量產生和轉化”中最大的分布。因此,我們主要關注不同微生物的氮代謝和固碳途徑。氮代謝表現為氨的運輸和同化。氮代謝途徑的關鍵轉錄本,如amoABCnirK隨著深水中DO濃度的降低而顯著增加(5a)。對于碳固定,奇古菌中3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(3-HP/4-HB循環)的轉錄本增加,但藍細菌中卡爾文(CBB)循環的轉錄本在低氧水域中減少(5b)。相反,各種轉運蛋白編碼基因的轉錄本,包括ATP結合盒(ABC)轉運蛋白、TonB依賴轉運蛋白(TBDT)DON轉運蛋白編碼基因(尤其是那些參與氨基酸、肽、核苷和維生素轉運的基因)的轉錄本,在低DO水環境的異養細菌中顯示出高豐度(6)。相對于與顆粒附著的微生物,自由生活的微生物表達更高的轉運蛋白相關轉錄本。自由生活群落中轉錄本的總表達量在表層水中最高,而顆粒附著群落中轉錄本的總表達量則呈相反的趨勢,底層水中轉錄本的總表達量較高(6)。在底層觀察到與奇古菌抗氧化能力在低DO濃度下具有更高水平的轉錄本,如超氧化物歧化酶和低效的過氧化氫清除編碼基因,無論自由生活態還是與顆粒附著態的生活方式(7)。


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         5、在自由生活態和顆粒附著態的奇古菌中核心編碼基因的轉錄本豐度,涉及脫氧沿海海水中的(a)氮和(b)碳代謝。

         

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         6、近岸脫氧海水中優勢微生物群落的轉運體的轉錄本豐度。

         

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         7、近海脫氧海水中優勢類群的抗氧化編碼基因的轉錄本豐度。
         

        研究結論

        本研究在脫氧水中觀察到奇古菌的高轉錄活性,其中氨氧化、氨轉運和碳固定途徑的核心基因的表達顯著增加。同時,藍細菌的轉錄本(特別是光合作用和固碳途徑)顯著減少。在低溶解氧濃度的底層水中,RuBisCO的轉錄本從光合自養轉變為化能自養方式。此外,異養細菌的轉錄本表明異養生物在轉化低分子量DON中起主要作用??寡趸幋a基因轉錄本的升高對應了低氧海水中奇古菌有氧代謝活性的增強??偟膩碚f,本研究的結果表明,奇古菌尤其是氨氧化的沿海生態型,對低氧水生環境有很強的適應能力,并進行化能自養固碳,對脫氧環境下的碳流動具有很大貢獻。
         


         

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        ●喜訊!天昊16S擴增子絕對定量測序項目文章登陸《Bioresource Technology》;

        祝賀!天昊客戶微生物擴增子項目成功登陸環境工程和食品科學一區雜志;

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