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        主頁 &amp;gt; 技術服務 &amp;gt; atac-seq開放性染色質測序

        ATAC-seq開放性染色質測序

        ATAC-seq開放性染色質測序

        服務介紹:

        真核生物的染色質通常情況下以核小體為單位進行致密的折疊,不表現出轉錄活性,同時部分開放的染色質區域作為特異性反式作用因子(如轉錄因子,酶等)和順式作用元件(如Enhancer,Insulator等)與基因組DNA相互作用的活躍區域。這種由染色質的開放程度定義的染色質可接近性(Chromatin Accessibility)對細胞的基因的表達,DNA的復制和修復等生命活動產生重要的影響,并且時刻受到細胞的嚴格調控。因此檢測特定時空狀態下細胞染色質的開放程度(從關閉狀態到半開放,從半開放到完全開放),是探索染色質結構重塑(Chromatin Remodeling)對生物的生長發育、疾病的發生發展影響的重要研究方向。
            ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing)方法利用高靈敏度的轉座酶(Transposase,Tn5)在尋找染色質上可接近位置的同時對染色質DNA進行片段化和接頭連接,擴增后進行高通量測序。細胞需求量在50000個左右,更適合數量有限的臨床珍貴樣本,實驗操作上更方便快捷,是一種創新的單堿基分辨率的表觀遺傳學研究技術。目前該技術已被廣泛應用于揭示染色質豐富的表觀調控信息、不同狀態下開放染色質的變化,以及多種疾病中開放染色質圖譜的繪制等,同樣適用于真核細胞重編程及單細胞染色質開放性的研究,在醫學領域是重大疾病發病機制、藥物作用機制、新藥研發和生物標志物等研究的重要利器。

        技術參數及分析內容


        技術優勢


           • 低細胞量需求:細胞量需求少,適合數量有限的臨床珍貴樣本。
           • 全基因組覆蓋:全基因組范圍內單堿基水平對染色質開放區域進行篩選與鑒定。
           • 高精確率:精確捕獲開放染色質區域,獲得調控序列信息,可同時對核小體信息進行研究。%
           • 操作簡便、高性價比:實驗耗時短,實驗步驟簡單,僅需較少數據量獲得全基因組范圍內有效調控信息。

        技術路線


        經典案例解讀

        文章標題:The Open Chromatin Landscape of Non-small Cell Lung Carcinoma

        發表雜志:Cancer Research

        影響因子:8.378

        發表時間:2019年6月

            2019年6月來自華西醫院的科研團隊于Cancer Research雜志發表了題為“The Open Chromatin Landscape of Non-small Cell Lung Carcinoma”的文章,結合50例原發性非小細胞肺癌(NSCLC)患者的開放染色質數據(ATAC-seq)、全基因組測序數據(WGS)和RNA測序數據(RNA-seq)揭示了NSCLC的開放染色質圖譜(Figure1A)。其中發現患者間開放染色質的異質性,異質性的程度與一些臨床參數相關,而且肺腺癌(LUAD)和肺鱗癌(LUSC)間也顯示出明顯不同的開放染色質模式。

        Figure1A 實驗總體設計思路

        主要研究結果:

        1. 實驗總體設計及樣本突變特征

            研究人員共收集了34例腺癌患者、13例鱗癌患者及4例非惡性結節患者(BSPN)的原發腫瘤樣本,同時收集40例NSCLC及2例BSPN患者對應的癌旁樣本供somatic突變calling(Figure1A)。其中絕大多數somatic SNVs和indels位于基因間區和內含子區(Figure1B)。與先前報道相似在NSCLC驅動基因中發現了一些somatic SNVs,包括TP53在26.92%的LUAD患者和33.33%的LUSC患者中,EGFR在19.23%的LUAD中,CSMD3在33.33%的LUSC中,NFE2L2在33.33%的LUSC中(Figure1C)。所有的LUSC樣本與富集的突變特征S3(與COSMIC signature 5類同)相關,而大多數LUAD樣本與突變特征S2(與COSMIC signature 9類同)相關(Figure1D)?;谒姆N突變特征的貢獻度將所有樣本進行聚類,絕大多數樣本聚類結果較好(Figure1E)。同時在這些樣本中發現很多已知基因存在顯著的擴增或缺失(Figure1F)。

        Figure1B-F NSCLC患者突變譜

        2. NSCLC開放染色質特征

            為了揭示開放染色質區域,利用ATAC-seq對每個腫瘤樣本進行測序。采用Jaccard index score評價樣本間開放染色質水平的異質性,發現NSCLC樣本間異質性比干細胞或分選的血液細胞顯著更高(Figure2A)。為了揭示樣本特定的peak能否顯示功能的特異性,利用少數peaks(minority peaks,在少于20%的樣本中出現)對樣本進行分類。有意思的是少數peaks與病理類型顯著相關,LUSC樣本包含更多的minority peaks,另外minority peaks的比例與更高的腫瘤分期、吸煙史、女性顯著相關,但與peak數、轉移與否和年齡無顯著相關性(Figure2B)。
            為了探索整體的開放染色質分布作為markers區分NSCLC樣本,利用ATAC-seq信號將這些樣本聚類成3個cluster(Figure2C)。其中cluster1有4個LUSC和4個LUAD樣本組成,這些樣本有顯著更少的開放染色質peaks以及更高的樣本間異質性(Figure2D),同時顯示出患者特異性的特征,而不是癌癥類型特征。Cluster2主要由LUSC樣本組成,開放染色質的TSS上下游2.5kb范圍發現了310個基因具有上調的表達,這些基因主要富集在角質化過程(Figure2E),這也是LUSC特定的現象,而非LUAD。Cluster3主要由LUAD樣本組成,可以進一步分為3個sub-cluster,這三個sub-cluster有明顯不同的開放染色質模式和不同的腫瘤分期(Figure2C)。

        Figure2 NSCLC開放染色質圖譜

            為了更好地理解瘤內異質性,對一例LUSC患者進行了單細胞ATAC-seq,對質控后的1651個細胞聚類發現7個主要的cluster,其中clutser3的開放染色質特征與bulk樣本具有高度一致性,97%的peaks出現在了bulk樣本中。因此在單細胞水平上觀察到一些開放染色質區域的高度異質性(Figure3)。

        Figure3 腫瘤單細胞ATAC-seq展示

        3. 寬的開放染色質peaks與NSCLC關鍵基因相關

            整合了白血病的ATAC-seq數據進行分析,發現寬的開放染色質peak相關的基因中,310個是NSCLC特異的,368個是Leukemia特異的,337個是共有的(Figure4A)。其中在3個樣本中EGFR的幾乎整個gene body區被開放染色質區覆蓋(Figure4B)。另外,寬的開放染色質peak相關的基因平均表達水平高于其它基因,但是僅38個基因具有顯著的差異表達(Figure4C)。寬的開放染色質peak相關的基因其表達水平變異系數更高(Figure4D)。

        Figure4 NSCLC寬的開放染色質區域

        4. Somatic CNV/germline SNV與開放染色質及基因表達間的關系

            文章最后整合多組學數據從somatic CNV的角度分析與開放染色質關系,同時結合基因表達數據發現同時具有somatic CNV和開放染色質的片段與基因表達有顯著的相關性,CNV gain其表達水平顯著更高,CNV loss其表達水平顯著更低(詳見原文)。
            另外從QTL的角度整合germline SNV、ATAC數據和基因表達數據發現某些基因的信息,同時與GWAS數據整合分析某些風險位點(詳見原文)。

        總結討論

            文章通過整合NSCLC腫瘤組織的多組學數據顯示這種類型的數據能夠揭示一些基因調控網絡,但是樣本量的限制使得分析具有一定的局限性!

        ATAC-seq片段大小揭示核小體片段信息

        轉錄起始位點為中心的上下游2kb區域信號分布

        樣本間差異peak可視化信息

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