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        主頁 &amp;gt; 技術服務 &amp;gt; mRNA甲基化(m6A)測序

        mRNA甲基化(m6A)測序

        mRNA甲基化(m6A)測序

        服務介紹:

            N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾是真核生物mRNA中最普遍的內部修飾,通常m6A修飾嵌入在5’-DRACH-3’ (D=G/A/U, R=G/A, H=A/U/C))保守的共有序列中,而且主要富集在終止密碼子區域,表明m6A修飾的分布特征可能具有重要的生物學功能。m6A RNA甲基化測序(MeRIP-seq或m6A-seq)是以RNA免疫共沉淀 RIP為基礎,采用特異抗體對發生m6A甲基化修飾的RNA片段進行富集后測序的技術手段,能夠準確識別~100個核苷酸區域的m6A修飾,在RNA表觀遺傳學領域被廣泛采用。

        技術參數及分析內容


        技術優勢


           • 開放的全轉錄組分析:無需預先設計探針,無需預知mRNA甲基化位點信息
           • 信息量大:在全轉錄組水平上獲得mRNA和poly(A)+長非編碼RNA的甲基化修飾區域信息
           • 準確性高:以未經抗體富集的mRNA文庫作為input對照,校正mRNA表達量的影響,獲得準確可靠的甲基化區域信息。

        技術路線


        經典案例解讀

        文章標題:METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma

        發表雜志:Molecular Cancer

        影響因子:10.679

        發表時間:2019年6月

            中山大學腫瘤防治中心徐瑞華教授和鞠懷強教授團隊在結直腸癌(CRC)中發現METTL3能夠基于m6A-IGF2BP2的機制促進腫瘤進展。鑒于結直腸癌中并未有太多關于m6A RNA甲基化修飾的報道,本研究首次在結直腸中證實了METTL3促癌的功能。

        主要研究結果:

        1. METTL3在轉移性CRC中高表達且與不良預后相關

            首先在TCGA數據庫中發現多個m6A相關‘寫蛋白/擦除蛋白/讀蛋白’的表達水平在結腸癌中異常表達(Fig.1a),qPCR驗證了其表達水平(Fig.1b)。由于METTL3在多個癌種中被證實高表達,進一步驗證發現METTL3在復發性CRC組織和轉移性肝組織也呈現表達上調(Fig.1c),而且mRNA和蛋白水平在CRC細胞系也顯示上調(Fig.1d-e)。
            METTL3蛋白水平在CRC患者中表達上調(Fig.1f),免疫組化結果驗證了METTL3在CRC組織、淋巴結和肝轉移組織中都顯示出高表達(Fig.1g-h)。更重要的是,METTL3高表達的患者化療效果更差(Fig.1i),整體生存率和無病生存率更低(Fig.1j)。

        2. SOX2受METTL3介導的m6A修飾調控

            METTL3在SW620細胞中顯示比SW480中具有更高的表達(兩種細胞系具有不同的轉移潛能,Fig.2a),然后利用MeRIP-seq和RNA-seq在SW480、SW620和METTL3敲降的SW620細胞中尋找潛在的靶點。綜合分析差異的甲基化peak和表達水平,發現與SW480細胞相比,SW620細胞中733個高甲基化peak同時具有更高的表達水平;在敲降的細胞中3393個低甲基化peak具有更低的表達水平(Fig.2b)。從這兩組結果中發現192個特異性的peak被共享(Fig.2c),與158個基因相關,通路富集發現這些可能參與干細胞分化的通路中(Fig.2d)。
            進一步對候選的基因分析發現四個基因SEMA3A、BCHE、ZFP36L2和SOX2在SW620細胞中顯示出m6A修飾的大幅增加,而在敲降細胞中顯示一致的減少(Fig.2e)。然而m6A-qPCR實驗證實SOX2的m6A水平在敲降細胞中下降得最顯著,因此SOX2可能作為METTL3的潛在靶點參與到促進CRC干性和轉移過程中(Fig.2f-h)。

        3. 體外實驗證實METTL3促進CRC細胞干性

            在METTL3敲降的SW620細胞中球體數目(Fig.3a-b)、菌落形成、侵襲能力均受影響(Fig.3c),而對奧沙利鉑的化療敏感性增加(Fig.3d),癌癥干細胞表面抗原CD133、CD44和EpCAM在METTL3被抑制后顯著下降(Fig.3e),同時METTL3下游基因也被顯著抑制(Fig.3f),另外SOX2過表達能夠rescue干性下降的表型(Fig.3g-i)。這些結果表明METTL3在CRC細胞中的致癌的角色,主要通過維持SOX2的表達實現促進腫瘤的自我更新、細胞侵入和化療抗性。

        4. 體內實驗證實METTL3驅動CRC腫瘤發生和轉移

            通過異種移植實驗發現METTL3敲降的細胞移植后腫瘤生長速率下降、腫瘤體積減小(Fig.4a-b);免疫組化發現尾靜脈注射對照組SW620細胞的小鼠會出現更多的肺轉移結節(Fig.4c)。同樣地,SOX2過表達能夠rescue腫瘤形成的功能(Fig.4d)。利用PDX模型瘤內注射siRNA評價METTL3的治療作用,主要結果也與上述一致(Fig.4e-h)。因此,體內實驗確實證實了METTL3在CRC中的成瘤和轉移作用。

        5. IGF2BP2基于m6A修飾的方式增加SOX2 mRNA穩定性

            先前有研究發現兩類m6A讀蛋白(readers)家族可能控制著甲基化修飾的mRNA的命運,如YTH家族和IGF2BP家族。為了揭示SOX2特定的m6A readers,利用鏈霉親和素RNA pull down實驗檢測相關的readers,發現IGF2BP2特異性地結合在SOX2全長轉錄本上,而非IGF2BP家族其它成員或YTH家族(Fig.5a)。而且pull down實驗也證實了IGF2BP2主要結合在CDS區,在motif缺失后特定的結合也會受到影響(Fig.5b)。RIP實驗同樣地證實了IGF2BP2和SOX2 mRNA之間直接的影響(Fig.5c)。
            在抑制IGF2BP2后SOX2蛋白和mRNA水平、SOX2下游基因表達水平均受到顯著抑制,IGF2BP2和SOX2轉錄本之間的作用也會受到METTL3的影響(Fig.5d-h)。在抑制METTL3或IGF2BP2后,SOX2 mRNA表達水平開始下降,而且其半衰期顯著變短(Fig.5i-j)。這些結果都能說明IGF2BP2確實充當reader的角色,維持SOX2轉錄本的穩定性。

        6. METTL3/SOX2/ IGF2BP2在CRC中的臨床相關性

            基于以上機制的發現,利用臨床樣本分析METTL3/SOX2/IGF2BP2之間的相關性,包括免疫組化實驗、表達相關性,利用三個marker的IHC數據對CRC患者進行預后的預測,三者的高表達顯示了最差的預后,因此可以建立一個很好的預測模型(Fig.6)。

        總結討論

            本研究發現了METTL3對于CRC進展的關鍵作用及可能基于m6A的機制,METTL3-IGF2BP2-SOX2之間的調控作用是基于m6A這一表觀調控機制來實現的,另外PDX模型顯示METTL3作為潛在靶點可能具有一定的治療作用。

        m6A peak在基因組各區域內的分布

        Peak calling結果

        Motif分析結果展示

        Peak相關基因GO富集條形圖

        KEGG富集分析散點圖

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