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        主頁 &amp;gt; 技術服務 &amp;gt; 常規微生物16S/18S/ITS擴增子測序

        常規微生物16S/18S/ITS擴增子測序

        常規微生物16S/18S/ITS擴增子測序

        服務介紹:

             擴增子測序就是通過對基因組目的區域進行PCR擴增,將目標區域DNA擴增富集后進行高通量測序,然后將得到的序列與特定數據庫比對,確認物種,然后進行生物信息分析的研究策略。目前擴增子測序服務主要包括細菌16S rDNA區/真菌ITS1區/真菌ITS2區/真菌18SrDNA區測序以及后續的數據分析工作,可有效研究特定環境中的物種信息,包括:物種差異、物種分類、物種豐度,對土壤,水體,瘤胃,淤泥等復雜環境中的微生物構成研究有重要的指導作用。

        16S rDNA測序:

            16SrRNA為核糖體的RNA的一個亞基,16SrDNA就是編碼該亞基的基因,存在于所有細菌基因組。16S rDNA大小適中,約1.5Kb左右,同時具有高度的保守性和特異性。16S rDNA既能體現不同菌屬之間的差異,又能利用測序技術較容易地得到其序列,目前已被廣泛用于病原菌的檢測和鑒定。

        18S rDNA測序:

            18S rDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。在結構上分為保守區和高變區,保守區反映生物物種間的親緣關系,高變區反映物種間的差異,18S rDNA在進化速率上相對于ITS更加保守。

        ITS 測序:

            在真核生物中,18S rDNA和28S rDNA轉錄間隔序列稱為ITS區。ITS分為兩個區域:ITS1/ITS2,ITS1位于18S和5.8S之間,ITS2位于5.8S和28S之間。ITS由于是非轉錄區,承受的選擇壓力較小,變異強。

        技術參數及分析內容


        技術優勢


           • 無需培養分離菌群,直接針對環境樣本進行擴增子測序。
           • 高通量測序,大數據量、低花費。
           • PCR擴增設置多次重復,低循環數擴增,客觀還原菌群結構及豐度比例。
           • 可發現環境微生物群落中新的微生物和基因,以及檢測痕量菌

        技術參數


        試驗流程


        經典案例解讀

        項目文章1:苦丁茶和茯磚茶可通過調節腸道菌群來預防肥胖

        英文題目:Kudingcha and Fuzhuan brick tea prevent obesity and modulate gut microbiota in high-fat diet fed mice

        中文題目:苦丁茶和茯磚茶通過調節高脂飲食喂養小鼠的腸道菌群來預防肥胖

        期刊名:Molecular Nutrition & Food Research

        發表時間: 2018年

        影響因子:4.323

        研究對象:

            32只雄性C57BL/6小鼠分為4組(每組8只):第一組小鼠給予正常飲食喂養+200微升水(ND組)、第二組小鼠給予高脂飲食喂養+200微升水(HFD組)、第三組小鼠給予高脂飲食喂養+200微升的400 mg/kg/day苦丁茶(KDC)提取物(HFD-KDC組)、第四組小鼠給予高脂飲食喂養+200微升的400 mg/kg/day茯磚茶(FBT)提取物(HFD-FBT組)。每組小鼠馴化一周后灌胃8天。每周測量食物攝入量和體重。糞便、肝、血、腎周脂肪組織和附睪脂肪組織實驗結束時收集,立即在液氮中冷凍保存在-80℃。

        生化分析、內毒素血癥和細胞因子測定:

        • 用商業試劑盒測定血清中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平及甘油三酯含量。
        • 用商用試劑盒測定肝臟中的甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量。
        • 用商業ELISA試劑盒測定血清中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、脂多糖(LPS)和C-反應蛋白。

        宿主基因表達量檢測:

            使用qPCR測定肝臟脂質代謝相關基因表達量:肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1(CPT-1)、過氧化物酶體增生物激活受體α(PPARα)、過氧化物酶體增生物激活受體γ(PPARγ)、固醇調節元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合酶(FAS)、肝X受體α(LXRα)。

        腸道菌群分析:

            細菌16S擴增子測序區段為:(V4);

        主要結果

        1. 苦丁茶(KDC)和茯磚茶(FBT)減弱HFD喂養小鼠的肥胖特征:

        • 在8周的飼養試驗中,高脂飲食(HFD組)小鼠的體重明顯增加,附睪和腎周脂肪積累,肝重和肝臟TG含量增加。但是補充FBT或KDC提取物能明顯減輕體重,這正好與附睪和腎周脂肪積累顯著下降,肝重和肝臟TG含量減少相符,并且這些指標與ND對照組沒有顯著差異。
        • 檢測了血清生化指標,包括TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。據觀察,高脂飲食導致TC和LDL-C水平顯著增加,和HDL-C水平顯著降低。補充FBT能顯著降低TG和LDL-C水平。這些結果表明,在FBT能減輕高脂飲食喂養小鼠血脂特征,而KDC對血脂水平的影響有限。

        2. FBT和KDC對高脂飲食喂養小鼠肝臟氧化損傷,血清炎癥和內毒素血癥的影響:

        • 據報道,高脂飲食可導致肝高氧化應激,有助于肝臟脂質沉積,從而導致肝臟的許多疾病。肝臟中的抗氧化酶如SOD、CAT和GSH-Px在控制脂質過氧化反應中起著重要作用。本研究發現高脂飲食導致肝臟中SOD, CAT和GSH-Px水平降低, MDA水平升高。而KDC和FBT則可以顯著預防高脂飲食誘導的肝臟氧化應激參數改變,例如KDC和FBT可以使SOD, CAT和GSH-Px水平升高,MDA水平降低。
        • 促炎性細胞因子和內毒素水平的升高已被報道與高脂誘導小鼠的肥胖相關疾病相關。本研究確實發現,相對于ND對照組,HFD組血清中具有更高水平的LPS、TNF-α、IL-6和CRP。而KDC和FBT則可以使LPS、TNF-α、IL-6和CRP水平顯著降低。

        3. FBT和KDC調控脂質代謝相關基因的表達:

        • 以往的研究表明,高脂飲食HFD可以調控肝臟脂肪酸合成和抗氧化基因的表達。實時定量PCR結果發現高脂飲食HFD引起LXRα, FAS, SREBP-1c和 PPARγ表達上調,CPT-1 和PPARα表達下調。而FBT與KDC可以顯著降低FAS,SREBP-1c和PPARγ表達。

        4. 腸道菌群對HFD, FBT和KDC的響應:

        • 高脂飲食HFD可以降低腸道菌群的多樣性,而FBT與KDC可以提高腸道菌群多樣性至ND對照組水平,另外KDC在改善腸道菌群多樣性方面效果更好。
        • PCoA分析可以把ND組和HFD組明顯分開(圖4A,B),同時可以把HFD組、HFD-FBT 組和HFD-KDC組明顯分開,這說明FBT與KDC對HFD喂養的小鼠腸道菌群確實有調節作用。PC1軸結果則說明FBT和KDC可以恢復被HFD破壞的腸道菌群結構至ND對照組水平。群落結構柱狀圖結果說明小鼠的腸道優勢菌群是厚壁菌門和擬桿菌門(圖4C)。HFD可以明顯改變腸道菌群結構,例如厚壁菌門豐度增加同時擬桿菌門豐度降低,另外HFD可以顯著提高厚壁菌門/擬桿菌門的比例,而FBT可以削弱這種增長趨勢至對照水平
        。 • 考慮到相同科水平下不同細菌對同一環境壓力(例如HFD)的反應不同,因此非常有必要鑒定被HFD, FBT和KDC改變的特定細菌類型,結果發現HFD處理可以使69個OTUs豐度上調,53個OTUs豐度下調;KDC處理可以使22個OTUs豐度上調,16個OTUs豐度下調;FBT處理可以使37個OTUs豐度上調,37個OTUs豐度下調(圖5)。被HFD影響的OTUs可以被KDC(30個)或者FBT(58個)逆轉,因此在調整高脂誘導的腸道菌群方面FBT比KDC更加有效。

        圖4 FBT和KDC調節高脂飲食破壞的腸道菌群組成。(a)腸道菌群的PCoA分析;(b)樣本UPGMA聚類樹;(c)門水平腸道菌群的組成;(d)厚壁菌門,擬桿菌門相對豐度,以及厚壁菌門/擬桿菌門比例。

        圖5 被FBT或KDC改變的100個OTUs相對豐度。(a)100個OTUs相對豐度熱圖;(b)被FBT或KDC影響的細菌類群(門、科、屬)變化方向。

        項目文章2:不同冰川年代的土壤細菌和真菌群落具有不同組合方式和驅動力

        英文題目:Divergent assemblage patterns and driving forces for bacterial and fungal communities along a glacier forefield chronosequence

        期刊名:Soil Biology and Biochemistry

        發表時間: 2018年

        影響因子:4.857

        研究目的:

            盡管微生物在冰川地區成土過程和生態系統發展中無處不在,并且起著關鍵的生態功能,但是細菌和真菌有著截然不同的演替軌跡,并且關于群落的驅動力仍不清楚。在這項研究中,分析了海螺溝冰川變化的七個不同階段相關細菌和真菌群落,量化其分類組成和演替動態,并從中解讀植物建立、土壤發育和線蟲對微生物演替軌跡的影響。

        研究對象:

            觀察到的海螺溝冰川衰退始于1823年,自20世紀初以來已明顯加速。這項研究是在7個經歷長期初級演替的地點進行的,它們分別處于末次冰消期后的不同時間(從裸土到開荒植被群落,最終達到頂極植被群落)。每個階段的大致年齡根據樹的年輪和137 Cs評估的土壤侵蝕速率進行校正,最終分為7個時間階段(1階段:冰川衰退后3年,到7階段:冰川衰退后120年)。
            在每個時間階段,使用3個5×5m的實驗地塊(在1和2階段,因為區域較小所以使用2×2m地塊)。植物群落的分類確定到種水平,以評估植物的豐富性(包括喬木,灌木和草本層),所有取樣的植物材料按種類進行分類,然后烘干和稱重。用一個直徑為5厘米的土壤取樣器從每塊地中心和5個角落采集土壤樣本,五份土壤混成一份樣本,通過2mm篩除去根,約200克的土壤分為三個部分:(1)土壤理化性質分析;(2)土壤線蟲群落分析;(3)土壤微生物生物量測定和DNA提取。

        技術方法:

            細菌16S rRNA擴增子測序(V4-V5)和真菌ITS1擴增子測序;

        研究結果:

        1. 微生物群落組成、結構和系統發育多樣性:

            優勢細菌主要是:變形菌門(44.19%)、酸桿菌門(21.25%)、擬桿菌門(9.11%)、浮霉菌門(4.1%)、放線菌門(3.57%)、綠彎菌門(3.10%)、芽單胞菌門(2.34%)和疣微菌門(2.03%)(圖1a)。
            優勢真菌主要是:子囊菌門(48.14%)、擔子菌門(36.84%)、接合菌門(4.13%)(圖1b)。分:(1)土壤理化性質分析;(2)土壤線蟲群落分析;(3)土壤微生物生物量測定和DNA提取。
            NMDS分析能把細菌整體分為三個群:第1階段為cluster1,第2-5階段為cluster2,第6-7階段為cluster3,三個cluster之間沒有重疊(圖1c)。NMDS分析能把真菌體分為2個群:早期(階段1-5)和后期(階段6 -7)(圖1d)。與真菌相比,每個時間階段的細菌聚集的更緊密(圖1c和d)。

        2. 共生網絡分析

            共生網絡表明細菌和真菌群落的復雜性在中間時間階段達到頂峰,其節點和邊緣數量最高(圖2)
            細菌重疊的節點主要屬于Proteobacteria(變形菌門)和Acidobacteria(酸桿菌門),真菌重疊的節點主要屬于Ascomycota(子囊菌門)和Basidiomycota(擔子菌門)(圖2)。

        3. 土壤和生物因素與微生物群落的關系

            通過冗余分析區分了3個細菌群落和2個真菌群落,在環境因子中,ph、總磷、土壤有機碳、凋落物C/N和植物豐富度與微生物群落密切相關(圖3a和b)。
            變分分析表明相對于生物因素,土壤性質在確定細菌和真菌群落結構方面更為重要,尤其是在早期階段1–5, 在最后的兩個階段,隨著森林的建立,生物因素以及生物和土壤互作越來越重要(圖3c和d)。
            結構方程模型表明,環境因素影響排名按以下順序:1)細菌: 土壤全磷(0.66)、土壤pH值(0.64),土壤SOC(0.44), 植物豐富度(0.36)和線蟲放牧(0.25); 2)真菌: SOC(0.62), 食線蟲(0.57), pH值(0.52),植物豐富度(0.48)和總磷(0.10)(圖3e、f)。

        4. 不同生物群的反應和驅動力對比

            四個生物群的豐富度和生物量表現出類似的反應。植物和線蟲的豐富度反應最高,細菌的豐富度反應最低,另一方面,真菌的生物量反應最大,其次是細菌、植物和線蟲。大多數生物群在第5階段達到最大的豐富度,在第6階段達到最大生物量,然后在后期下降。
            隨機過程支配細菌和真菌群落的變化,而確定性過程支配著植物群落的形成,相反,在線蟲中確定性和隨機過程大致相等。在最后兩個階段,決定論對細菌和真菌的重要性增加了,與細菌相比,真菌群落組成有更強烈的隨機性驅動力。

        圖1 海螺溝冰川不同演替階段的細菌(A,C)和真菌(B,D)物種組成和NMDS分析。

        圖2 海螺溝冰川不同演替階段的細菌(A)和真菌(B)共生網絡分析。

        圖3 海螺溝冰川不同演替階段的細菌和真菌群落與環境因素的RDA(a,b)、VPA(c,d)和SEM(e,f)分析。AP速效磷;SOC土壤有機碳;TN總氮;TP總磷。實心箭頭和虛線箭頭分別表示正相關和負相關,箭頭的粗細反映標準化系數大小。

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