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        咨詢熱線:400-065-6886   天昊基因

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        主頁 &amp;gt; 技術服務 &amp;gt; Accu16STM細菌絕對定量測序

        Accu16STM細菌絕對定量測序

        Accu16STM細菌絕對定量測序

        服務介紹:

          常規16S rRNA擴增子測序技術雖然其具有高通量,低花費,可客觀還原菌群結構及相對豐度比例的巨大優勢,但是其是通過某一OTU分類單元的序列數所占總序列數的比值來獲得某個細菌的相對豐度比例信息,然而相對豐度信息不能反映樣本中物種真實的絕對豐度情況,例如微生物某一類群的相對豐度比例增加不一定真正是相應微生物類群的絕對豐度增加,可能是其它微生物類群的絕對豐度減少是導致其在群落結構中相對豐度比例的增長,因此常規16S擴增子測序技術基于相對定量分析的錯誤結果解釋可能導致假定的因果關系! qPCR絕對定量技術雖然可以進行物種絕對定量分析,但是qPCR定量實驗結果常常不穩定,且特定物種qPCR需要設計特定引物,對引物特異性要求較高,且引物優化難度較大,導致常規的qPCR絕對定量實驗不再適用于組成較為復雜的環境樣本微生物絕對定量。此外,當環境樣本中往往含有腐殖酸,這些腐殖酸會通過抑制酶的活性抑制PCR,從而影響qPCR對細菌拷貝數定量結果的準確性。
          天昊生物Accu16STM細菌絕對定量測序是一種將qPCR絕對定量技術和常規16S rRNA擴增子測序技術合二為一的技術,該方法通過向樣品DNA中添加一定量內標序列,然后進行16S rRNA擴增子文庫構建、測序,再根據內標序列的16S擴增子序列數及其絕對拷貝數繪制標準曲線,計算出樣品中OTU代表序列對應物種16S rRNA基因絕對拷貝數。該技術不但可以進行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析、指標和微生物相關性分析等常規16S rRNA擴增子測序分析,關鍵可以解析樣本中總細菌的絕對拷貝數,還可以解析樣本中每個物種的絕對拷貝數,因而對微生態學內許多懸而未決的問題具有進一步闡明的潛力。此外,該技術進行細菌拷貝數定量時,構建標準曲線的內標和樣本DNA是在同一個樣本孔中一起進行PCR反應,所以PCR反應效率相同,因此校正了腐殖酸對PCR的影響,避免了腐殖酸等PCR抑制物對樣品細菌16S拷貝數定量的影響,因此針對土壤、水體和淤泥等環境樣本,天昊生物Accu16STM細菌絕對定量測序技術計算得到的細菌16S拷貝數相對于qPCR更準確。

        技術參數及分析內容

        技術優勢:

          • 數據量大:不低于15萬reads/樣品,可檢測環境微生物群落中的痕量菌,以及發現新的微生物。
          • 性價比高:可同時獲得樣本菌群的相對定量分析結果和絕對定量分析結果。
          • 適用范圍廣:可同時得到包括低豐度菌在內的絕大多數物種的絕對定量數據,具有普遍適用性。
          • 真實準確:絕對定量數據,客觀還原菌群結構及真實豐度,無樣品偏差可直接比較,此外可以排除環境樣本(例如土壤,水體和淤泥)中腐殖酸等PCR抑制劑對微生物絕對定量的影響。

        技術參數


        分析流程



        天昊項目文章

        項目文章1(土壤):長期施氮降低了捕食性粘細菌的相對豐度和絕對拷貝數,改變了土壤中粘細菌群落結構

        英文題目:Long-term nitrogen application decreases the abundance and copy number of predatory myxobacteria and alters the myxobacterial community structure in the soil

        期刊名:Science of the Total Environment

        影響因子:6.551

        研究概要:

        粘細菌是一種具有特殊社會生活方式(Social lifestyle)的微生物捕食者,這種社會性細菌(Social bacteria)在細菌域是獨一無二的。這些捕食者在土壤微生物食物網中代謝活躍,具有驅動土壤微生物種群的能力。然而,施肥處理對農業系統中捕食性粘細菌的影響常常被忽視。本文采用高通量絕對豐度定量方法,對湖南祁陽紅壤試驗站施肥29年的農田中的粘細菌相對豐度和絕對拷貝數進行了研究。利用16S擴增子絕對定量測序技術,共檢測到419個粘細菌OTUs,占細菌總豐度的0.25-2.70%。PCoA、ANOSIM和Manhattan analysis結果表明,施氮(N簇)和施豬糞(M簇)的粘細菌群落結構存在顯著差異(p<0.05)。施加氮肥顯著降低了粘細菌的相對豐度、拷貝數、物種積累指數和Shannon指數(p<0.05)。UpSet plots結果表明,氮肥處理的粘細菌OTUs數量僅為豬糞(M)處理的24.4%,施氮造成低豐度粘細菌OTUs數量的減少。此外,網絡分析、RDA分析和隨機森林RF分析表明,粘細菌相對豐度和絕對拷貝數是預測土壤細菌群落和功能基因α-和β-多樣性的重要變量(P<0.05)。研究結果表明,施氮肥引起的土壤酸化是導致土壤粘細菌相對豐度和絕對拷貝數下降的最主要原因;粘細菌相對豐度和絕對拷貝數的變化與細菌的α-和β-多樣性指數的變化顯著相關,粘細菌群落的變化可能是影響整體微生物群落變化的重要因素。

        實驗設計:

        長期試驗田于1990年在中國農業科學院祁陽紅壤實驗站建立,設計了12種常用施肥處理:1)不施肥對照(control, CK);2)氮化肥 (N);3)氮磷化肥 (NP);4)氮鉀化肥 (NK); 5)磷鉀化肥 (PK);6)氮磷鉀化肥 (NPK);7)氮磷鉀化肥配施豬糞 (NPKM) ;8) 1.5倍用量的氮磷鉀化肥配施豬糞(1.5NPKM);9)氮磷鉀化肥配施秸稈;10)氮磷鉀化肥配施豬糞+大豆輪作(NPKMR);11)豬糞(M);12)休耕(Nature)。每種處理共采集四個土壤樣品(生物學重復),隨機選擇三個樣本用于進一步研究。

        細菌絕對定量測序:

        使用FastDNA? SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)提取土壤DNA,然后在上海天昊生物科技有限公司進行細菌絕對定量測序(V4-V5區域)。

        圖1 施肥處理對土壤粘細菌群落相對豐度(A)和拷貝數(B)的影響,以及基于相對豐度與拷貝數PCoA 軸1的相關關系(C)。


        圖3 曼哈頓圖顯示了M處理土壤相對于N處理土壤中富集的粘細菌的相對豐度(A)和絕對拷貝數(B)。顯著富集的OTUs被描繪為填充三角形,顯著減少的OTUs被描繪為空心三角形,不顯著的OTUs被描繪為全圓。虛線對應于p值=0.05顯著性閾值。每個點的顏色代表了OTU(科水平)的分類隸屬關系,每個點的大小對應于36個土壤樣品中OTU的平均相對豐度或絕對拷貝數。


        項目文章2(生物膜):中試規模兩級潮汐流人工濕地中多孔基質和功能菌屬的協同作用對低溫下營養物質的高效去除

        英文題目:The synergy of porous substrates and functional genera for efficient nutrients removal at low temperature in a pilot-scale two-stage tidal flow constructed wetland

        期刊名:Bioresource Technology

        影響因子:7.539

        研究概要:

        以頁巖陶粒(SC)和活性氧化鋁(AA)為填料,構建日處理量為0.46 m3 / d的中試規模兩級潮汐流人工濕地TFCW(SC-AA-TFCW),用于低溫(<15℃)營養物質的去除。SC-AA-TFCW對氮和磷的去除率分別為78.1%和98.3%。SC-TFCW對有機物的去除率為55.2%,對顆粒物的去除率為85.6%。在17種反硝化細菌中,好氧反硝化細菌(ADNB)的絕對豐度最高,其次是兼性厭氧反硝化細菌(FADNB)和自養反硝化細菌(AUDNB)。氮同化為有機氮、異化同化硝酸鹽還原和完全反硝化(完全脫氮)可能是氮代謝的主要途徑。一些好氧反硝化細菌(ADNB)(如Zoogloea, Pseudomonas和Acidovorax)與營養物質去除相關的關鍵功能基因之間存在正交互作用。溶解氧和還原元素是改變好氧反硝化細菌(ADNB)組成的主要環境因素。 這項研究強調了好氧反硝化細菌(ADNB)的重要性及其在SC-AA-TFCW中對多孔基質的協同作用。

        SC-AA-TFCW的構建和運行:

        實驗是在中型SC-AA-TFCW上進行的,該SC-AA-TFCW由SC-TFCW和AA-TFCW組成,并具有相同的配置(長×寬×高= 1000 mm×800 mm×800 mm)。每個下行TFCW主要由入口區、基底區和出口區組成(圖1)。相鄰區域由隔板隔開,隔板上有均勻分布的小孔,用于分配水。在進水區,建立了由多孔PVC管組成的水分配器,以實現均勻的水分配?;讌^域(長×寬×高=1000mm×800mm×600mm)全部填充SC或AA。美人蕉(Canna indica L.)以16株/m2的初始密度種植在每個TFCW基質區上表面。為了保持進水水質穩定性,合成廢水的平均濃度保持在300 mg / L化學需氧量(COD),40 mg / L NH4 +-N,5 mg / L總氧化氮(TON,亞硝酸鹽和硝酸鹽之和),2 mg / L PP和4 mg / L TDP。根據這些平均值,分別用葡萄糖,NH4 Cl,KNO3,骨粉(直徑<0.074 mm)和KH2 PO4制備合成廢水。SC-AA-TFCW通過自動控制系統連接,該系統由進水箱,污水泵,電磁閥和液位傳感器組成?!俺毕\行”模式(填充-接觸-排水-休息)的實施策略如下:1)為了在啟動階段(從第1天到第41天)在SC和AA中更快地進行生物降解,進水池的廢水通過啟動泵、電磁閥1和電磁閥2快速(3分鐘)加載到SC-TFCW上,接觸時間為2小時,之后通過啟動泵、電磁閥3和電磁閥4將所有廢水快速(3分鐘)加載到AA-TFCW上,并與基質保持接觸2小時,然后啟動電磁閥5將廢水快速排出;2) 為了在穩定階段(第42天至第114天)更穩定地去除氮和磷,在其他操作參數不變的情況下,AA-TFCW的接觸時間從2小時延長到10小時。

        樣品采集與測定:

        每周兩次從每個TFCW的入口和中間收集水樣。根據標準方法(APHA,2012)測量了包括COD、NH4 +-N、NO2?-N、NO3?-N、TN、TDP、PP和TP等參數。借助于便攜式Hach HQ30d多參數分析儀測量溶解氧(DO),pH和溫度。在第10天、第41天、第60天和第114天,從每個TFCW的中間位置采集三份微生物樣本,將三份樣品混合作為一個生物膜樣品,用于進一步的微生物分析。本研究采集了8個生物膜樣品,包括SC10、AA10、SC41、AA41、SC60、AA60、SC114和AA114。

        細菌絕對定量測序:

        使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit (Omega Biotek, U.S.)從8個生物膜樣品中提取微生物DNA。DNA樣品送至上海天昊生物科技有限公司進行細菌絕對定量測序(V3-V4)。

        圖4 SS-AA-TFCW中8個生物膜樣品的主要屬(至少一個樣本絕對拷貝數>1500 copy/ng DNA)的絕對定量:(a)主要細菌屬的熱圖;(b)潛在反硝化菌的總豐度。圖(a)中的1、2、3分別代表好氧反硝化細菌(ADNB)、兼性厭氧反硝化細菌(FADNB)和自養反硝化細菌(AUDNB)。


        項目文章3(糞便):綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素的鏈構象、理化性質及其體外發酵

        英文題目:Chain conformation, physicochemical properties of fucosylated chondroitin sulfate from sea cucumber Stichopus chloronotus and its in vitro fermentation by human gut microbiota

        期刊名:Carbohydrate Polymers

        影響因子:7.182

        研究概要:

        本文采用HPSEC-MALLS和worm-like cylinder模型方法研究了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc)的鏈構象和理化性質,同時通過16S擴增子絕對定量測序研究它對人體腸道菌群的影響。結果表明綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc) 在PBS中采用剛性棒狀鏈構象,鏈構象參數分別為αη(1.11)和αh(0.70)。從worm-like cylinder模型推導出的剛度參數表明fCS-Sc表現為剛性鏈。剛果紅分析顯示為單螺旋結構。fCS-Sc在較寬的ph范圍內表現出負的zeta電位和良好的熱穩定性。此外,fCS-Sc還可以通過提高腸道菌群的絕對豐度來調節腸道菌群的群落結構,例如增加有益菌Megamonas、Bacteroides、Fusobacterium、Parabacteroides、Prevotella、Faecalibacterium,抑制病原微生物,從而促進短鏈脂肪酸的產生。本研究進一步加深了對fCS-Sc空間結構的認識,以及fCS-Sc作為益生元的應用。

        fCS-Sc體外發酵:

        根據文獻報道,對fCS-Sc進行了體外發酵研究。將fCS-Sc或低聚果糖(FOS,陽性對照)溶于培養基中(10mg/ml),高壓滅菌。新鮮糞便樣本來自三名自愿捐贈者(兩名女性和一名男性,年齡25-35歲),他們在三個月內沒有胃腸道疾病或抗生素治療。將每個供者的相同量糞便樣本混合,用PBS稀釋成10%(w/v)的糞漿,以500rpm離心5min,除去食物殘渣。然后,將9ml空白培養基(對照組)或含fCS-Sc或FOS的培養基與1ml糞漿混合。將混合物立即放入厭氧培養箱中,37℃孵育24小時。在Silgreen陽離子交換柱(300×7.8mm)上分析培養基中的SCFAs含量,用8mM H2 SO4洗脫,215nm檢測。

        細菌絕對定量測序:

        使用FastDNA? SPIN Kit (MP Biomedicals, LLC, USA)提取樣本微生物基因組DNA,然后在上海天昊生物科技有限公司進行細菌絕對定量測序(V3-V4)。

        圖6 主要細菌在門(a)和屬(b)水平上的相對豐度和絕對豐度


        結果展示

        1) 樣本OTU代表序列對應物種16S rRNA基因絕對拷貝數計算

        a) 向樣本中添加內標序列,然后對樣品DNA和內標序列DNA進行16S擴增子測序。
        b) 使用內標序列 DNA的序列數,結合其絕對拷貝數,以log(copies)為橫坐標,log(reads)為橫坐標,繪制標準曲線:

        圖1 Y4樣品的標準曲線


        c) 根據標準曲線計算的樣品中優勢OTU序列(Top10)的起始拷貝數:

        表1 根據標準曲線計算的樣品中優勢OTU序列(Top10)的起始拷貝數

        d) 根據各樣品內部的標準曲線計算出各樣本總細菌絕對拷貝數和各菌絕對拷貝數情況:


        2) 內標序列的添加對樣本原有群落組成影響不大

        以下是比較淤泥樣本A兩次測序結果,兩次測序編號分別為A_V4(未添加內標序列)、Y42_V4(添加106 copies 內標序列)。
        a. 同一樣本添加不同拷貝數內標序列測序物種相對豐度比較:

        結果顯示:Y4_V4、Y42_V4樣本優勢菌屬完全一致,且這些菌屬在各個樣本中的相對豐度比較一致,說明內標序列的添加對樣本屬水平的群落組成無明顯影響,添加內標序列后的樣本16S測序結果也能反映樣本本身群落組成情況。

        b. 同一樣本添加不同拷貝數內標序列得到的優勢OTU代表序列拷貝數:

        結果顯示:比較同一樣本中添加不同量內標序列測得的優勢OTU代表序列的絕對拷貝數,結果發現Y42_V4(添加106 copies 內標序列)和Y4_V4(添加107 copies 內標序列)同一OTU代表序列拷貝數一致性較好,說明Accu16STM細菌絕對定量測序的重復性和穩定性均較好,能夠真實定量出樣本中各個物種的絕對豐度。


        3)Accu16STM細菌絕對定量測序和qPCR絕對定量相比,準確度在同一水平

        較了Accu16STM細菌絕對定量測序方法與熒光定量qPCR方法所測定的同一系列樣本的細菌總拷貝數,Pearson相關性分析結果顯示:相關系數大于0.9,且兩種方法計算的細菌總拷貝數值較為接近,未超過一個數量級,說明通過Accu16STM細菌絕對定量測序技術進行微生物絕對定量是可靠準確的。


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