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        【昊閱讀】移植前和移植后連續暴露于疾病相關的腸道微生物能夠促進野生型小鼠的超急性移植物抗宿主病


        原創 上海天昊生物 


        圖片
         

        英文題目:Continuous pre- and post-transplant exposure to a disease-associated gut microbiome promotes hyper-acute graft-versus-host disease in wild-type mice
        中文題目:移植前后持續暴露于疾病相關腸道微生物能夠促進野生型小鼠的超急性移植物抗宿主病
        期刊名:GUT MICROBES 
        影響因子:10.243  (一區Top)
        發表時間:2020年7月

         

         

        研究概要

         
        研究目的:腸道微生物在異體造血干細胞移植后急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的發展中起著關鍵作用。在這里,我們使用一個小鼠模型來研究移植前和移植后腸道微生物群對急性GVHD的個體貢獻。實驗方法:將野生型小鼠與對超急性GVHD敏感的IL-17RA-/-小鼠共同飼養。糞便樣本是從移植前后的WTIL-17RA-/-小鼠中收集的,并使用宏基因組測序分析微生物組。實驗結果:僅通過移植前共同飼養來引發野生型小鼠不足以加速GVHD,然而,僅在移植后共同飼養的WT小鼠中觀察到疾病的加速。當小鼠在移植前后連續共同飼養時,引發和惡化的效果是相加的,導致WT小鼠的疾病加速比僅在移植后共同飼養看到的更快。微生物組的宏基因組分析顯示移植前相同宿主與Muribaculaceae科中尚未培養的細菌菌屬內特定的兩個菌種CAG-485CAG-873的轉移有關。移植后,我們觀察到Enterobacteriaceae中的Escherichia coliEnterobacter hormaechei subsp. steigerwaltiiGVHD發展相關。這種超急性GVHD與遲發性疾病(>移植后10)相關的腸道微生物明顯不同。研究結論:這些結果闡明了移植前后腸道微生物在移植后對于急性GVHD易感性疾病的重要性,并證明這種聯系具有細菌物種的特異性。

         

         

        背景介紹

         
        移植物抗宿主病(GVHD)是造血干細胞移植的一種嚴重并發癥,發生率為3050%。這種疾病的特征是T細胞介導的目標器官組織損傷,包括皮膚、肝臟和胃腸道。事實上,在包含T細胞的非相關干細胞移植中,幾乎所有急性GVHD的致命病例都與胃腸道有關,3-4期腸道GVHD發病后2年的總存活率為25%。在實驗證明無菌和抗生素治療的小鼠疾病嚴重程度降低后,腸道微生物群最初被認為是腸道GVHD發展的關鍵因素。移植前給予調理方案以消融免疫系統對于成功移植是必要的,然而,這些治療導致的組織損傷允許微生物和微生物產物的移位(例如,脂多糖)從胃腸腔進入循環,觸發炎性細胞因子TNF、IL-1IL-6的釋放,這種病原體相關分子模式和炎性細胞因子的體循環導致宿主抗原呈遞細胞的激活,隨后引發分化和供體T細胞的擴增,以及導致靶組織破壞的壓倒性免疫反應??股刂委熜纬闪艘恍┱{理方案,旨在繞過這一過程,然而,對抗菌藥物耐藥性的擔憂意味著這種做法并不普遍。對人類和動物健康至關重要的共生微生物系統的破壞也可能對移植受體施加進一步的壓力,從而潛在地影響恢復。有趣的是,我們最近證明了腸道微生物群在影響腸上皮細胞導致GVHD啟動的MHC II類表現中的關鍵作用。因此,有必要增加我們對腸道微生物群在調節腸道GVHD發展中的精確作用的理解,以期設計更有針對性的預防或治療策略。
         
        對腸道微生物在GVHD中的作用的研究很復雜,因為在GVHD發生之前和同時觀察到微生物的波動。在患病時,小鼠和人類腸道內的細菌多樣性隨著組成的巨大變化而減少。腸桿菌科、乳桿菌科和腸球菌科的細菌成員都顯示出隨著疾病的發展而豐富度增加,通常在整個群落中占主導地位。移植時患者腸道微生物多樣性的減少,但在GVHD開始之前,與疾病死亡率的增加有關,特別是,Blautia物種豐度的降低與人類GVHD有關。急性GVHD的發展與移植前患者體內厚壁菌門豐度的增加以及整體多樣性水平的降低有關,表明移植前腸道微生物的組成也可能起作用。了解腸道微生物在GVHD的發展中是否有一個決定性的時期,對于充分闡明這種關系的性質至關重要。
         
        我們最近在GVHD小鼠模型中觀察到糞便微生物與超急性GVHD發展之間的關聯。在研究了IL-17RA-/-小鼠中的獨特微生物群落(移植后持續發展超急性GVHD的小鼠基因型)后,發現通過與IL-17RA-/-小鼠共同飼養,可在WT小鼠中誘發加速相關疾病。共同飼養前后的糞便微生物群分析顯示,群落成員主要來自IL-11。然而,由于小鼠在整個實驗過程中被共同飼養,尚不清楚移植前共同飼養是否足以誘發加速疾病,或者移植后共同飼養是否也有助于這一結果。為了確定是否有一個基本的共居期,進而確定微生物的基本轉移,我們用移植前或移植后單獨共居的小鼠進行了額外的實驗。這些數據表明,持續暴露于IL-17受體缺陷小鼠的疾病相關微生物菌群對于在WT小鼠中最大程度誘導超急性GVHD是必要的。移植后共同飼養僅導致移植后疾病進展率介于非共同飼養WT對照組和連續共同飼養WT小鼠之間。僅在移植前共同飼養不足以顯著加速疾病。因此,移植前啟動的有害效應只有在移植后暴露于IL-17RA-/-小鼠時才能實現。

         

         

        研究方法

         
        小鼠和異體干細胞移植
        野生型C57BL/6小鼠(本文稱為野生型WT)購自動物資源中心。采用C57BL/6背景的IL-17RA-/-小鼠進行內部繁殖。動物程序采用QIMR伯格霍夫動物倫理委員會批準的協議對小鼠進行移植和監測。簡而言之,受體小鼠接受1000 cGy的全身照射。重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)10 mg劑量皮下注射給供體小鼠6天。小鼠移植25 × 106T細胞或20 × 106T細胞衰竭(TCD)G-CSF的脾細胞。所有移植的小鼠都被安置在滅菌的微型隔離籠中,并接受酸化高壓滅菌水。使用已建立的評分系統評估GVHD,并根據機構指南處死臨床評分≥6的小鼠。來自連續共同飼養實驗(1a)的數據已經在以前發表過。
         
        宏基因組數據處理、組裝和MAG分析
        使用BWA v0.7.12,以小家鼠基因組(GRCm38.p5)作為參考基因組,最小30個堿基的比對長度和最大15個剪切堿基的讀序被認為是小鼠來源的。使用metaSPAdes v3.12.0來獨立組裝每個樣本中的非小鼠讀序。Binning分析通過使用BamM v1.7.3 (https://github.com/ecogenomics/BamM)來將六個樣本的子集讀序映射到每個結果來組裝的,使用MetaBAT v2.12.1對最小長度為2000個堿基的contig來進行恢復。使用CheckM v1.0.12評估生成的bin的污染程度和完整性,使用dRep v2.2.395%的最小二級平均核苷酸同一性(-sa 0.95)取消完整性> 75%和污染< 7%bin。使用GTDB-Tk v0.3.0和基因組分類數據庫(GTDB)版本04-RS89確定得到的MAGs的分類隸屬關系。
         
        宏基因組群落圖譜
        使用最小種子長度為25BamM,將每個樣品的讀序映射到GTDB 03-RS86(> 80%完整,< 7%污染)16,958個細菌和古細菌基因組的去重復集合(dRep,95%)中。使用Mosdepth v0.2.3測定的基因組> 1x覆蓋范圍> 1%和總覆蓋范圍0.01X的基因組被保留,并與回收的一組去重復的MAG結合,用于評估群落組成。最終的237個基因組包括從這項研究中回收的95MAG,加上來自NCBI142個基因組。通過使用BamM對最小種子長度為25個堿基進行比對并隨后過濾最小百分比同一性為95%來確定每個樣品的最終基因組組的讀序計數。每個基因組讀序計數被計算以說明基因組大小,同時保持每個樣本的原始未映射讀序百分比作為對多樣性的反映。相對豐度是使用比例讀序計數作為每個樣品的總非宿主讀序的一部分來計算的。α多樣性使用QIIME v1.8.0計算,計數使用RDESeq2 v1.20.0.中實現的大小因子方法進行標準化,MAGs使用Prokka v1.12.進行注釋
         
        功能注釋
        MAGs原始讀序和預測蛋白質的功能注釋通過與HMMER v3.1b2比對隱藏馬爾可夫模型數據庫dbCAN CAZy v6 Pfam r32TIGRFAM v15 (MAGs)進行,最大e值截止值為1e-10。KEGG矯正是通過BLAST v2.8.120177月下載的UniProt UniRef數據庫的比對確定的,最大e值為1e-10,隨后提取相關的KO術語。
         
        Muribaculaceae MAG分析
        基于120個單拷貝標記基因的比對,使用恢復的MAGs加上公開可得的基因組構建了Muribaculaceae基因組樹。使用IQ-TREE v1.6.9 (100個重復,非參數)LG+C10 + F + G模型推斷自舉最大似然樹,后驗平均位點頻率≥50%序列(38,690個位置)內殘基的比對位置。使用e值截止1e-6Proteinortho v5.16b鑒定直向同源蛋白質?;驑涫鞘褂迷诨謴偷?/span>Muribaculaceae MAGsGTDB版本03-RS86中鑒定的同源物構建的,由GeneTreeTK v0. 0 .14 (https://github.com/dparks1134/GeneTreeTk)使用默認設置。自舉最大似然樹(100個重復,非參數)使用IQ-TREE v1.6.9構建,ModelFinder用于模型選擇。最小相似度為30%的比對位點用于系統發育推斷。ARB用于排列過濾和樹的優化。
         
        大腸桿菌MAG分析
        通過對比VFDB核心數據庫對恢復的MAGs和公共基因組進行BLAST搜索,對入庫和未入庫大腸桿菌重疊群中的毒力因子進行預測,最大e值截止1e-10,最小比對同一性為30%,最小比對分數為70%。毒力因子類別從VFDB VFanalyzer下載的參考基因組中獲得。使用CD-HIT命令,以具有99%的同一性(-c 0.99)90%的較短序列覆蓋率(-aS 0.9)閾值對所有小鼠未結合重疊群進行聚類。通過對NCBI nt數據庫的BLAST搜索,確定了與大腸桿菌同源的代表性重疊群,最大e值閾值為1e-10,然后過濾含有“大腸桿菌”的序列描述,最小比對同一性為97%,最小比對分數為查詢重疊群的50%。使用上述相同的方法從SRA實驗SRR3340629、SRR5050584、SRR5050585SRR5050587中得到額外的大腸桿菌MAG。
         
        統計分析和圖形表示
        使用Kaplan-Meier估計繪制存活曲線,并通過對數秩分析進行比較。Wilcoxon秩和檢驗用于α多樣性值的統計分析,利用Benjamini-Hochberg調整進行多重比較。P <0.05被認為具有統計學意義。點圖表示為平均值的平均標準誤差。使用R package vegan v 2.5-1對數據進行主成分分析,使用metagenomeSeq v1.22.0.對對數累積和標度(log-CSS)進行標準化。使用DESeq2 v1.20.0中的Wald檢驗,基于總的注釋讀序計數或每個基因組的讀序計數,對樣本組之間的細菌分類群和功能注釋的差異豐度進行評估,并使用Benjamini-Hochberg調整進行多重比較。P <0.001被認為具有統計學意義。sPLS-DA分析使用RmixOmics v6.3.2進行,使用中心對數比轉換的相對豐度值(偽計數1e-07)50xM倍交叉驗證(移植前WT5倍,移植后WT3)。使用EnrichM v0.5.0 (https://github.com/geronimp/enrichM)Fisher精確檢驗對與早發和遲發性GVHD相關的MAGs中的功能注釋進行比較,Fisher精確檢驗用于比較與每種疾病類型相關的每個功能類別(即每個單獨的CAZy、KOPfam分類)MAGs編碼/非編碼數量(使用Benjamini-Hochberg調整進行多重比較)。Spearmanrho使用R軟件包psych v1.8.12中的“corr.test”函數計算,使用中心對數比率轉換的相對豐度值進行多重比較的Benjamini-Hochberg調整。過濾最小相對豐度≥0.05%的細菌家族。p< 0.05被認為具有統計學意義。熱圖使用Rpheatmap v1.0.10制作,箱圖使用Rggplot2 v2.2.1制作,點圖等利用GGally v1.4.0GraphPad Prism v8.0.1 (GraphPad軟件)制作。

         

         

        研究結果

         
        與異常微生物的共處對WT小鼠在急性GVHD的發展中起到引發和加重作用
        為了確定暴露于IL-17受體缺陷小鼠的微生物是否有一個關鍵時期能夠在WT小鼠中誘導加速GVHD,我們比較了涉及連續共同飼養小鼠(I)、僅移植前小鼠(II)或僅移植后小鼠(III)的移植結果(1a)。我們之前公布了實驗1的存活曲線和基于16S rRNA的分析,并且在本研究中使用了已公布實驗的DNA進行宏基因組分析。我們假設移植前共同飼養為WT腸道群落的病原體置換和疾病做好準備,并且移植后共同飼養通過暴露于高病原體負荷而加劇疾病進展。僅在移植前共飼養小鼠(II)導致總存活時間減少,然而,與單獨飼養的WT小鼠沒有顯著差異(中位存活時間分別為33天和45天;P =0.3605)(1b)。僅在移植后共飼養小鼠(III)更有害,與單獨飼養的WT小鼠相比,所有WT小鼠都死于疾病,總體疾病率顯著加快(中位生存期28天對45天;P =0.0015)(1b)。然而,與連續共同飼養的WT小鼠相比,與移植后共同飼養(III)相關的WT小鼠的疾病惡化顯著延遲(中位生存期28天對9天;P =0.0057)(1b)。雖然連續共同飼養的WT小鼠(I)在移植后4天開始死于疾病,但移植后但未在移植前進行共同飼養的存活的WT小鼠至少存活了23天。我們認為疾病啟動的這種滯后可歸因于移植前WT小鼠缺乏微生物組依賴性啟動。因此,雖然移植前共同飼養的啟動效應不足以在隔離狀態下加速疾病,但當與移植后惡化結合時,與僅移植后共同飼養的WT小鼠相比,啟動小鼠對加速GVHD明顯更敏感。
         
        為了獲得轉移微生物的物種級別分辨率以及它們的功能潛力,我們對每個共同飼養場景的一個實驗復制的糞便樣本進行了宏基因組測序,包括之前通過16S rRNA擴增子測序分析的連續共同飼養小鼠。對來自在移植前和移植后以及共同飼養前相同小鼠的樣本進行了測序。還在移植前和移植后來自單獨飼養的(對照)小鼠進行了分析。為了評估細菌群落組成,我們首先進行了基因組恢復,產生了一組代表15個細菌家族的95個元基因組組裝基因組(MAGs)。對這些MAGs和一組可公開獲得的基因組的讀序比對證實了疾病的發展與細菌群落的實質性轉變有關。不管共同飼養治療如何,WTIL-17RA-/-小鼠的疾病相關微生物組的組成是可區分的。排序分析表明,與連續共同飼養的小鼠相比,WTIL-17RA-/-小鼠之間的疾病相關腸道群落存在更廣泛的差異。在移植后的WT小鼠中,連續共同飼養也與群落多樣性的顯著降低相關,而當共同飼養僅發生在移植前或移植后時,群落多樣性沒有顯著降低。這些數據表明,移植前或移植后共同飼養的WT小鼠比連續共同飼養的WT小鼠經歷了與疾病發作相關的轉變,這與在這些小鼠中觀察到的延遲疾病表型一致(1)。


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        1、連續共同飼養加速移植后WT小鼠的GVHD。

         

        在組成水平上,在實驗一和實驗二的WT小鼠中,來自Muribaculaceae (以前未培養的譜系S24-722)的五個細菌物種在共同飼養期間增加(圖2)。這些物種在共同飼養的WT小鼠中也明顯多于單獨飼養的WT小鼠。在兩個實驗中,在共同飼養過程中唯一被富集的non-Muribaculaceae物種是Prevotella sp002933775。然而,該物種的平均共居后豐度顯著低于Muribaculaceae物種(0.3%對1.7%)。我們還對來自所有三個實驗的所有移植前小鼠進行了更廣泛的分析,并確定了典型易感移植后早發性GVHD的小鼠(IL-17RA -/-和移植前共同飼養的WT小鼠)和典型表現出遲發性疾病的小鼠(單獨飼養的WT小鼠)之間的不同微生物組組成(圖2b)。與每種疾病類型相關的MAGs的比較沒有揭示Pfam、KEGG和CAZy數據庫之間的任何顯著功能差異,進一步支持啟動效應發生在這些功能類別的水平之下或可能由表達的變化驅動。對所有移植前WT小鼠的多變量分析也揭示了非共同飼養和共同飼養WT小鼠之間的區別(圖2d)。Muribaculaceae物種一直被認為是這種劃分和區分早發和遲發疾病的關鍵(圖2c)。這些發現與我們之前對移植前和移植后共居的WT小鼠進行的16S rRNA基因測序分析的結果一致,該分析將Muribaculaceae家族的成員確定為通過共居改變相對豐度的優勢分類群。
        在富集的Muribaculaceae物種中,四個是CAG-873屬的成員,一個是CAG-485屬的成員,這兩個屬目前都缺乏培養的代表。在移植前共同飼養過程中耗盡的Muribaculaceae物種也屬于CAG-873(GVHD27),這表明啟動效應必須至少是物種特異性的。兩種(CAG-485 sp。GVHD19CAG-873 sp。GVHD29)顯示了相對豐度模式;在共同飼養實驗期間,兩者在WT小鼠中持續增加,并且在疾病發作后在WT小鼠中也觀察到。


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        圖2、Muribaculaceae的物種在共同飼養期間能夠轉移并與疾病易感性相關。

         

        與不良微生物持續共存促進了Enterobacteriaceae相關疾病的爆發
        由于與GVHD發病相關的腸道微生物組組成發生了很大的變化,我們最初在細菌家族水平上比較了每組WT小鼠的疾病相關微生物組與移植前的組成。無論何時共同飼養發生,Enterobacteriaceae在共宿主的WT小鼠中顯著富集,連續共同飼養與該科的顯著富集相關(3)。在物種水平上,在所有三種共同飼養情況下,WT小鼠移植后Enterobacteriaceae豐度顯著增加的大部分是Escherichia coli 。因此,持續共同飼養可能會通過Enterobacteriaceae物種的擴大而促進急性疾病,超過小鼠在替代共同飼養情況下所經歷的情況。


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        3、Enterobacteriaceae細菌數量的增加與疾病有關。

         

        移植后存活率與微生物組成有關
        在所有三種共同飼養情況下,我們記錄了移植后WT小鼠的一系列存活時間;一些小鼠迅速死于GVHD,類似于IL-17RA缺陷小鼠,而另一些小鼠超過一個月沒有發病(1)。利用移植后存活長度的這種分布,我們確定了Enterobacteriaceae的豐度與移植后WT小鼠的存活之間的負相關,以及Muribaculaceae的豐度與存活之間的正相關(4a)。這些趨勢在基因組水平上也是可以觀察到的。隨后,我們根據移植后存活時間的可觀察聚集性,定義了三種疾病類型進行進一步比較:高度急性(存活≤10)、中度(存活2035)和延遲(存活45+)(4a)。排序分析表明,具有超急性疾病(WTIL-17RA/)的微生物組組成與具有中度或延遲疾病發作的微生物組組成之間存在差異(4bc)。超急性GVHDE. coliB. vulgatus的顯著高豐度相關(4d,表S21)。中度或延遲性疾病與MuribaculaceaeLachnospiraceae的豐度較高有關。


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        4、移植后的存活時間與微生物組成的改變有關。

         

         

        研究結論

         
        在這里,我們研究了移植前和移植后腸道微生物群對超急性GVHD發展的影響。我們觀察到在移植前從IL-17RA-/-小鼠到WT小鼠的共同飼養過程中,細菌Muribaculaceae成員的轉移,以及移植后與疾病相關的Enterobacteriaceae成員的增加。連續共同飼養與Enterobacteriaceae的增加有關,包括E. coli和E. hormaechei subsp. steigerwaltii。我們的結果證明了特定物種與疾病結果的關聯,利用糞菌移植FMT等方法促進細菌多樣性可能是減少干細胞移植后急性GVHD發展的更成功策略。

         

         

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