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        盤點新型冠狀病毒相關研究中單細胞轉錄組技術的應用(二)


        原創 上海天昊生物 
         
        上期相關鏈接:盤點新型冠狀病毒相關研究中單細胞轉錄組技術的應用(一)
        2019冠狀病毒?。–OVID-19),由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起,據世界衛生組織統計,截至2021年9月2日,已造成2.18億人感染,至少452萬人死亡。單細胞RNA測序(scRNA-seq)在解析免疫反應方面有強大的能力,已被廣泛應用于COVID-19的研究,現整理2021年以來部分重要研究中scRNA-seq相關內容供讀者閱讀參考:


         

        單細胞多組學


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        對人類血液免疫細胞的分析為協調應對病毒感染(如導致COVID-19的SARS-CoV-2提供了見解。這項研究對來自130名不同嚴重程度COVID-19患者的橫斷面隊列的超過78萬個外周血單個核細胞進行了單細胞轉錄組、表面蛋白組和T、B淋巴細胞抗原受體分析。結果發現了表達補體轉錄本(CD16+C1QA/B/C+)的非經典單核細胞的擴張,它們隔離血小板,并被預測在COVID-19中補充肺泡巨噬細胞池。早期未定向的CD34+造血干/祖細胞向巨核細胞生成啟動,伴隨巨核細胞定向祖細胞擴張和血小板激活增加。嚴重疾病表現為CD8+ T細胞的克隆擴增和CD8+效應T細胞/效應記憶T細胞比例的增加,而循環濾泡輔助T細胞伴隨輕度疾病。另外觀察到在有癥狀的疾病中IgA2的相對丟失,盡管漿母細胞和漿細胞整體擴張。這項研究強調了促成COVID-19發病機制的協調免疫反應,并揭示了可以靶向治療的離散細胞成分。


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        死亡病例的肺單細胞圖譜


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        呼吸衰竭是嚴重SARS-CoV-2感染患者死亡的主要原因,但肺部組織水平上的宿主反應尚不清楚。這項研究對19名死于COVID-19的患者和7名對照組患者的肺部約11.6萬個細胞核進行了單核RNA測序,這些患者接受了快速尸檢。綜合分析確定了細胞組成、轉錄細胞狀態和細胞間相互作用的重大變化,從而提供了對致命COVID-19生物學的深入了解。COVID-19患者的肺部高度炎癥,異常激活的單核細胞來源的巨噬細胞和肺泡巨噬細胞密集浸潤,但T細胞應答受損。與其他病毒和細菌引起的肺炎相比,單核細胞/巨噬細胞來源的白細胞介素-1β和上皮細胞來源的白細胞介素-6是SARS-CoV-2感染的獨特特征。肺泡2型細胞處于炎癥相關的短暫祖細胞狀態,未能完全過渡到肺泡1型細胞,導致肺再生受損。此外,發現最近描述的CTHRC1+病理成纖維細胞的擴張,導致COVID-19迅速發生肺纖維化。對蛋白質活性和配體受體相互作用的推斷確定了可能破壞有害環路的藥物靶點。該圖譜有助于解析致命的COVID-19,有助于我們了解COVID-19幸存者的長期并發癥,并為開發治療方法提供重要資源。


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        抗原呈遞細胞的單細胞圖譜


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        COVID-19可導致危及生命的呼吸衰竭,炎癥介質和病毒載量增加。這項研究利用單細胞RNA測序建立了一個高分辨率的血液抗原呈遞細胞(APCs)圖譜,包括15例中度或重度COVID-19肺炎患者在進入重癥監護室或肺科第一天和第四天的樣本以及4個健康的捐贈者。結果生成了一個包含81,643個APCs的獨特數據集,包括單核細胞和罕見的樹突狀細胞(DC)子群。發現了重癥患者特異性APCs抗病毒免疫防御的多過程缺陷:(1)漿細胞樣DCs(pDCs,抗病毒免疫的關鍵效應器)中促凋亡通路的增加,(2)pDCs和CLEC9a+ DCs中固有傳感器TLR9和DHX36的減少,(3)單核細胞亞群中抗病毒干擾素刺激基因的下調,(4)cDC1c+ DCs中MHC II類相關基因和MHC II類反式激活因子活性的降低,表明病毒抑制了抗原呈遞。這些新的機制可以解釋患者的病情加重,并建議修復缺陷免疫防御的策略。


         

        特異性B細胞單細胞圖譜


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        分析記憶B細胞(MBCs)對抗SARS-CoV-2的進化對理解抗體二次暴露回憶至關重要。這項研究使用單細胞測序分析了38例COVID-19患者的SARS-CoV-2反應性B細胞。利用寡核苷酸標記的抗原誘餌,分離出了SARS-CoV-2刺突蛋白、核蛋白(NP、開放閱讀框8(ORF8)和地方性人類冠狀病毒(HCoV)刺突蛋白特異性的B細胞。SARS-CoV-2刺突特異性細胞在急性感染和恢復期患者發病數月后的記憶中富集。在嚴重的急性感染中,大量的地方性HCoV反應性抗體分泌細胞群被鑒定出來,并具有高度突變的可變基因,表明預先存在免疫。最后,隨著時間的推移,MBCs表現出對NP和ORF8的明顯成熟,特別是在老年患者中。針對這些靶點的單克隆抗體在體內不具有中和和保護作用。這些發現揭示了抗體在感染過程中對非中和性細胞內抗原的適應性,強調了疫苗接種對誘導中和性刺突特異性MBCs的重要性。


         

        單細胞測序驗證髓系受體表達


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        盡管有越來越多的證據表明SARS-CoV-2與免疫細胞相互作用,但大多數細胞幾乎不表達SARS-CoV-2的典型受體——血管緊張素轉換酶2ACE2)。該研究使用了一個聚焦于髓細胞細胞受體的異位表達篩選,確定了幾種C型凝集素(DC-SIGN、L-SIGN、LSECtin、ASGR1和CLEC10A)和Tweety家族成員2(TTYH2)作為SARS-CoV-2刺突的糖依賴結合因子。除了TTYH2外,這些分子主要通過受體結合域外的區域與刺突相互作用。來自COVID-19患者肺部細胞的單細胞RNA測序分析表明,這些分子主要在髓樣細胞上表達。盡管這些受體不支持SARS-CoV-2的主動復制,但它們與病毒的結合在髓樣細胞中誘導了與COVID-19嚴重程度相關的強大的促炎反應。研究還發現了一種雙特異性抗刺突納米體,不僅可以阻斷ACE2介導的感染,還可以阻斷髓系受體介導的促炎反應。這一研究結果表明,SARS-CoV-2髓系受體相互作用促進免疫過度激活,這是COVID-19治療的潛在靶點。


         

        胰島單細胞測序


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        最近的臨床數據表明,COVID-19和糖尿病之間存在相關性。這一研究描述了COVID-19患者尸檢樣本中胰腺細胞中SARS-CoV-2病毒抗原的檢測。體外感染的單細胞RNA測序和免疫染色證實,多種類型的胰島細胞對SARS-CoV-2易感,引發細胞應激反應和趨化因子的誘導。在SARS-CoV-2感染后,β細胞中胰島素表達較低,胰高血糖素和胰蛋白酶1等α和腺泡細胞標志物表達較高,提示細胞轉分化。軌跡分析表明SARS-CoV-2誘導eIF2途徑介導的β細胞轉分化,該表型可被反式-綜合應激反應抑制劑(trans-ISRIB)逆轉??傊?,本研究展示了SARS-CoV-2感染導致細胞命運改變的一個例子,為進一步了解COVID-19的發病機制提供了依據。


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        多組學數據整合分析


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        多種模式的同時檢測代表了單細胞基因組學的一個激動人心的前沿領域,需要基于多模式數據定義細胞狀態的計算方法。這項研究引入“加權最近鄰”分析,這是一個無監督的框架,用來了解每個細胞中每種數據類型的相對效用,從而實現對多種模式的綜合分析。研究將該程序應用于CITE-seq數據集,該數據集包含211,000人外周血單個核細胞,包括228種抗體的panel以構建循環免疫系統的多模態參考圖譜。多模態分析極大地提高了解決細胞狀態的能力,使我們能夠識別和驗證以前未報道的淋巴亞群。此外,研究人員還驗證了如何利用這一參考來快速比對新的數據集,并解釋對疫苗接種和COVID-19的免疫反應。這一方法代表了一種廣泛適用的策略用于分析單細胞多模態數據集,并超越轉錄組,尋找細胞身份的統一和多模態定義。


         

        B細胞單細胞VDJ+RNA測序


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        單克隆抗體(mAbs)是對抗 SARS-CoV-2及其變異的疫苗和治療設計的重點。這項研究結合B細胞分選、單細胞VDJ、RNA測序和mAb結構來描述B細胞對SARS-CoV-2的應答。結果發現SARS-CoV-2特異性B細胞庫由轉錄上不同的B細胞群組成,細胞產生強大的中和抗體(nAbs),定位于類似記憶和激活B細胞的兩個細胞群。這兩個細胞群與SARS-CoV-2刺突三聚體結合后,在冷凍電子顯微鏡下所選擇的nAbs結構顯示出對各種受體結合域(RBD)表位的識別。其中一種單克隆抗體BG10-19將刺突三聚體鎖定在一個封閉的構象中,以有效中和SARS-CoV-2、最近出現的突變體B.1.1.7和B.1.351以及SARS-CoV,并與異種RBDs交叉反應??傊?,這些結果描述了SARS-CoV-2特異性B細胞之間的轉錄差異,并發現了交叉中和抗體靶點,這將為針對冠狀病毒的免疫原和治療設計提供信息。


         

        mRNA疫苗接種+單細胞驗證


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        在SARS-CoV-2出現后不到一年時間內緊急批準兩種mRNA疫苗的使用,是疫苗學上的一個里程碑。然而,mRNA疫苗是如何刺激免疫系統引起保護性免疫反應的還不清楚。本研究使用系統疫苗學方法全面分析了56名健康志愿者接種輝瑞-拜恩泰科(Pfizer–BioNTech)mRNA疫苗(BNT162b2)后的先天和適應性免疫反應。接種第二次疫苗后,抗野生型SARS-CoV-2(來源于2019-nCOV/USA_WA1/2020)和B.1.351毒株(較小程度)的中和抗體大量產生,抗原特異性多功能性CD4和CD8 T細胞顯著增加。與初級疫苗相比,強化疫苗刺激了明顯增強的先天免疫反應,證據如下:(1)CD14+CD16+炎癥單核細胞的頻率更高;(2)血漿INFγ濃度升高;(3)先天抗病毒免疫的轉錄特征。與這些觀察結果一致,單細胞轉錄組學分析表明,在二次免疫后,富含干擾素反應轉錄因子的髓細胞簇的頻率增加了約100倍,而AP-1轉錄因子的頻率減少了。最后,研究鑒定了與CD8 T細胞和中和抗體應答相關的獨特先天途徑,并表明單核細胞相關特征與針對B.1.351變體的中和抗體應答相關??偟膩碚f,這些數據提供了對由mRNA接種誘導的免疫反應的深入了解,并證明了其在增強免疫后啟動先天免疫系統發出更強回應的能力。

         

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